四、核酸的分子杂交
核酸分子的固相杂交是将待测核酸样品结合在某种固相支持物上，然后与溶液中的标记探针进行杂交。目前使用最多的固相支持物是硝酸纤维膜。这里重点介绍直接点样技术，转移技术及其它常用的杂交技术。
[b]（一）斑点杂交的直接点样法[/b]
斑点杂交或叫打点杂交（dot-blot hybridization），其主要特点是事先不用限制内切酶消化或用凝胶电泳分离核酸样品，操作简便，灵敏度高。一个点样品只含0.25～1pg的DNA也能检测到。但不知道杂交片段的大小（碱基对数）。
1．DNA的打点法（DNa Dot Blot）
（1）膜的处理：戴上干净手套，取出硝酸纤维膜，按需要剪成一定大小，量好各样点间距离，用软铅笔标记。
（2）DNA变性：将DNA溶液于1×TE（pH8.0）缓冲液中或蒸馏水中，取一定量DNA样品加于小塑料管中，在100℃沸水中煮10min，迅速入冰水中。
（3）点样：用塑料或硅化玻璃或微量加样器取1～5μl变性DNA，将滴管放在硝酸纤维膜上，使DNA慢慢吸在滤膜上，点样完后凉干。
（4）固定：将凉干的滤膜夹在滤纸中，于80℃干烤2～3h，然后进行杂交。
2．RNA的打点法（RNa Dot Blot）
（1）膜的处理：同DNA的打点法。
（2）RNA变性：将提取的RNA与50μl 20×SSC/甲醛（30μl20×SSC加20μl甲醛）混合，65℃水浴15min。
（3）点样：同DNA的打点法。
（4）固定：同DNA的打点法。
[b]（二）DNA的吸印转移法（Southern Blot）[/b]
DNA经过限制性内切酶消化和凝胶电泳后，放入碱性溶液中使其变性，将变性后的单链DNA从凝胶中按原来位置和顺序用滤纸吸印转移到硝酸纤维膜上，然后再与标记探针杂交。此方法比较准确地保持了特异DNA序列在电泳图谱中的位置，而且能测定分子量。
试剂：变性液：0.5mol/L NaOH, 1.5mol/L NaCl
中和液：1mol/l Tris-HCl, 1.5mol/L NaClpH8.0
20×SSC:0.3mol/L柠檬酸钠，3mol/l NaCl
1．电泳 取DNA约5μg加限制性内切酶进行酶切，电泳鉴定酶切完全后，取酶消化后的DNA点样于0.8%～1.2%的凝胶上，以0.8～1V/cm电压电泳过夜，在溴酚蓝离凝胶前缘0.5cm处停止电泳。将电泳后的凝胶翻转，紫外灯照射10～20min后拍照。
2．变性与中和 将电泳后的凝胶放入变性液中25℃振荡60min。蒸馏水洗胶1min，将凝胶放入中和液中25℃振荡60min。
3．转移 取托盘一只，放入10×SSC溶液约500～1000ml，托盘上搭一块比凝胶稍宽的长方形玻璃，取一长方形Wateman paper（滤纸）搭在桥上，两边浸入10×SSC溶液中，仔细去掉玻璃与滤纸之间的气泡（用玻棒在滤纸上滚动）。将凝胶放在滤纸上，去掉凝胶与滤纸之间的气泡。将硝酸纤维膜放入2×SSC溶液中浸湿后放在凝胶上（如NC膜浸湿不均匀，则考虑更换NC膜，操作时手切勿触及NC膜），去掉凝胶与NC膜之间的气泡。将一张滤纸（长和宽均比NC膜小1mm）放在NC膜上，仔细去掉气泡。将吸水纸切成与滤纸大小，重叠放在滤纸上，再压一重物约500～1000g。转膜24h，中间更换吸水纸。
[img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/shiyongmianyixibaoyuhesuan/shiyongmianyixibaoyuhesuan127.jpg[alt]Southern转膜示意图 [/alt][/img]
图23-7 Southern转膜示意图
4．固定用2×SSC溶液洗膜5min去掉残余凝胶，让膜自然凉干。将凝胶放入EB液中30min，取出在UV灯下观察是否有DNA残余。80℃烤膜2h，然后将膜封入塑料袋进行杂交。
[b]（三）RNA的吸印转移法（Northern blot）[/b]
在RNA凝胶电泳之前，先用乙二醛等变性剂处理RNA，再在适宜条件下电泳使充分变性的RNA直接吸印到硝酸纤维膜上。固定后除去变性剂，然后进行杂交。
试剂：
乙二醛：4mol/L（约为30%），经过阴阳离子交换树脂纯化，使pH为5.5～6.0
磷酸缓冲液：80mmol/L pH6.5～7.0
磷酸缓冲液：10mmol/L pH6.5～7.0
Tris-HCl:20mmol/L pH7.8
二甲基亚砜：分析纯
20×SSC：0.3mol/L柠檬酸钠，3mol/l NaCl
1.RNA变性 吸取1μl 80mmol/L磷酸缓冲液，1μl RNA样品（最多100μg），2μl，4mol/l 乙二醇，4μl二甲基亚砜。混匀后，50℃水浴1h，然后放入冰中。
2．电泳 变性结束后，加入含有50%甘油的10mmol/L磷酸缓冲液2μl和少量溴酚蓝，混匀后点样于1.0%的凝胶上，以4～5V/cm电压电泳。凝胶电泳液为10mmol/L磷酸缓冲液，pH6.5～7.0。
3．转移 变性处理后的RNA可以转移并结合到硝酸纤维膜上，转移过程和转移变性与DNA相同。
4．固定 用20×SSC转移RNA。膜夹在两层干净滤纸中凉干后，80℃烤膜2h
5．乙二醛附加物消除 RNA膜固定后，放入20mmol/l Tris-HCl中，100℃处理5～10min，去除乙二醛，然后进行杂交。
[b]（四）硝酸纤维膜固相杂交[/b]
核酸样品经过直接点样或转移到硝酸纤维膜上，固定后，可以进行杂交反应。在杂交溶液中，硝酸纤维膜上变性的核酸样品和变性后的探针在一定的条件下形成双链杂交核酸分子。然后进行酶标显色。
试剂及操作方法见本节 三。
