三、柯斯质粒

1978年Collins和Hohn构建一种新型的大肠杆菌克隆载体,命名为cosmid(柯斯质粒)。它是用正常的质粒同噬菌体λ的cos位点构成。例如,柯斯质粒pHC79系由质粒pBR322和噬菌体λ的cos位点的一段DNA构成(图23-5),全长43.kb。在包装时,cos位点打开而产生噬菌体λ的粘性末端。由于pHC79有pBR322DNA,所以也就有氨苄青霉素抗性和四环素抗性两个标记。图23-5说明了克隆基因时有用的限制酶切点。所以可以说柯斯质粒是一类特殊的重组质粒。 [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/shiyongmianyixibaoyuhesuan/shiyongmianyixibaoyuhesuan125.jpg[alt]柯斯质粒pHC79 [/alt][/img] 图23-5 柯斯质粒pHC[XB]79[/XB] 设计构建的柯斯质粒一般长4~6kb。其上的cos位点的一个重要作用是识别噬菌体的外壳蛋白。凡具有cos位点的任何DNA分子只要在长度相当于噬菌体基因组,就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体λ的颗粒。因此,插入柯斯质粒的外源DNA可大于40kb。重组的柯斯质粒可象噬菌体λ一样感染大肠杆菌,并在细菌细胞中复制。如把宿主菌在含氯霉素的培养基中生长,柯斯质粒可以扩增到宿主细胞DNA总量的50%左右。 采用柯斯质粒作载体的困难是:①载体自身只相当于可以插入片段的1/10左右,因此往往会出现载体同载体自身连接,结果在一个重组分子内可有几个柯斯质粒载体连在一起。但用碱性磷酸酶处理,可阻止载体分子自身连接;②大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子,结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一个片段,会影响实验结果的分析,后来专门选出30~45kb的外源DNA插入载体DNA,此时,每个载体只可能插入一个外源片段,因为如果二处片段,则将超过包装成噬菌体颗粒的限度;③细菌的菌落体积远大于噬菌斑,因此如用柯斯质粒制备基因文库,则筛选所需的含某一DNA片段的菌落很费时间。现虽建立了高密度菌落筛选法,但由于柯斯质粒制成的基因文库常常不太稳定,插入的大片段外源DNA有可能通过同宿主基因组交换而致丢失等,所以最常使用的还是噬菌体载体。 现将上面提到的四种载体作一比较(表23-3) 表23-3 四种载体的比较
 质粒λ噬菌体柯斯质粒单链噬菌体
克隆DNA大片段±[SB]*[/SB]++-
构建基因组文库-++-
构建cDNA文库+---
常规的亚克隆化+---
构建新型的DNA结构+---
序列分析+--+
单链探针+[SB]**[/SB]--+
外源基因在大肠杆菌中的表达+---
* 外源DNA如超过10kb,则重组质粒的转化率和DNA得率都非常低 ** 已有个别质料可用于此目的