十一、定量PCR

1．DNA-PCR定量用同位素标记的探针与电泳分离后的PCR扩增产物进行杂交，根据放射自显影后底片曝光强弱可以对模板DNA进行定量。Abbot等利用这种方法对人类T细胞白血病反转录基因进行了定量研究。 PCR扩增产物用专为检测ds-DNA而设计的微量荧光计定量，利用染料H33258专与双链DNA结合而使荧光增强50倍的特性。可以从标准模板系列稀释扩增产物量曲线上读出样品中模板DNA的量或拷贝数，达到PCR定量的目的。 利用倍比稀释模板作系列稀释PCR，求出最低（PCR-EB）检测限来比较，也是常用的半定量PCR方法。 2．mRNA-PCR定量由于MRNA-PCR定量需经两个酶（RT和Taq）催化，因而影响因素较多。1989年Wang等报道了低丰度mRNA绝对定量方法。利用浓度已知且与待测靶mR-NA序列相同的内对照mRNA（其片段长短不同，便于PCR扩增后产物的分离），在同一体系中，用相同的由[SB]32[/SB]P标记的引物与待测mRNA一同进行逆转录和PCR扩增，扩增产物电泳后，分别测定二者产物放射性强度，由预先制备的标准曲线推算出每个样本特异mRNA的量。Gilliland等的结果表明，在1ng总RNA中可以对小于1pg的特异mRNA进行定量。这一定量方法在肿瘤、代谢失调、基因表达调控等研究中均有重要意义。