九、玻片PCR

在聚丙烯管中可以对多种含膜板材料进行PCR,而在显微玻片上用组织细胞涂片或切片直接进行DNA扩增的方法就称为玻片PCR(Slide-PCR)。 [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/shiyongmianyixibaoyuhesuan/shiyongmianyixibaoyuhesuan114.jpg[alt]锚定PCR原理示意图 [/alt][/img] 图22-3 锚定PCR原理示意图 先将细胞涂片或呈单层细胞,然后用甲醇/醋酸(3:1,V/V)、Carnoy溶液、无水乙醇或4%多聚甲醛溶液固定5~15min。用蒸馏水冲洗,干燥,直接使用或保存于-20℃备用。在玻片上划20mm×28mm为免疫组化反应区。加入30μl PCR反应混合液,其中含10mmol/L TrispH8.3,50mmol/L KCl,1.5mmol/L MgCl[XB]2[/XB],200μmol/l dNTPs,100nmol/L引物,0.01%(V/V)明胶,0.2%BSA, 2.5u/100μl Taq酶。然后盖上22mm×40mm的盖玻片,边缘用石蜡油封好。把玻片放入PCR热循环仪金属块上,使金属块与样品呈最大程度接触,同在聚丙烯管中一样,进行30~40个循环。对于较短的扩增片段在后期循环中变性温度可降低。反应后,将致冷玻片放在氯仿中除去大部分石蜡油,但不取出盖玻片,用一个尖镊子轻轻拈起盖玻片一角,在相对的一角中PCR反应混合液呈半月形液面,用移液器回收。一般可回收25μl混合液,将反应产物进行琼脂糖电泳或用套式PCR引物按标准PCR进行重新扩增。片上扩增物可做原位杂交显示。 在Slide-PCR中,需0.1%~1%的BSA。加入BSA可以保证扩增结果,但效率不一定很高。明胶(至少0.0001%),对扩增1kb左右的靶DNA十分重要。但对小片段扩增结果影响不大。不同的样品提取方法或固定法对Slide-PCR都可行。 Silde-PCR的机理可能是在起始变性过程中一部分DNA从细胞中洗提出来,然后在细胞和玻片的水相中进行PCR。用地高辛标记的人全基因组DNA探针杂交表明在起始循环中DNA极微量,而30个循环后很丰富。常规细胞染色表明只有少量的形态改变。 Silde-PCR对于玻片上的细胞样品提供了一种较好的方法,而不必再把这些样品从玻片上括下来,使操作简便,污染减少。本方法对于原样品量极微且需病史追踪保存的(如子宫颈涂片或涂片)具有实用价值。