(二)四种脱氧三磷酸核苷酸(4×dNTPs)
在PCR反体系中dNTP终浓度高于50mmol/L会抑制Taq酶的活性,使用低浓度dNTP可以减少在非靶位置启动和延伸时核苷酸错误掺入,高浓度dNTPs易产生错误掺入,而浓度太低,势必降低反应物的产量。PCR常用的浓度为50~200μmol/L,不能低于10~15μmol/L。四种dNTP的浓度应相同,其中任何一种浓度偏高或偏低,都会诱导聚合酶的错误掺入,降低合成速度,过早终止反应。
决定最低dNTP浓度的因素是靶序列DNA的长度和组成,例如,在100μl反应体系中,4×dNTPs浓度若用20μmol/L,基本满足合成2.6μg DNA或10pmol的400bp序列。50μmol/L的4×dNTPs可以合成6.6μgDNA,而200μmol/L足以合成25μg/DNA。
购自厂商的dNTP溶液一般均未调pH,应用1mol/l NaOH将dNTP贮存液pH调至7.0,以保证反应的pH值不低于7.1。市购的游离核苷酸冻干粉,溶解后要用NaOH中和,再用紫外分光光度计定量。