一、PCR操作范例

在一个典型的PCR反应体系中需加入：适宜的缓冲液、微量的模板DNA、4×dNTPs、耐热性多聚酶、Mg[SB]2+[/SB]和两个合成的DNA引物。模板DNa 94℃变性1min，引物与模板40～60℃退火1min，72℃延伸2min。在首次循环前模板预变性3～5min；在末次循环后，样品仍需继续延伸3～5min以上，确保扩增的DNA为双链DNA。为便于了解PCR反应中各成份的组成，加入量和反应条件，使人们以此为基础，对不同的研究对象逐项改变来找到最佳反应条件，特列举Perkin Elmer Cetus公司Gene Amp DNA试剂盒提供的典型反应条件供参考。 表22-1 PCR反应混合液

成分	加入体积（μl）	最终浓度
双蒸馏水	53.5
10×反应缓冲液[SB][1][/SB]	10.0	[1×]Mg[SB]2+[/SB]1.5mmol/l K[SB]+[/SB]50mmol/L
4×dNTPs(各1.25mmol/L)	16.0	各200μmol/L
λ-DNA模板（全长48.5kD）	10.0	1ng/次
引物1,2（各25bp,20μmol/L）[SB][3,4][/SB]	5.0	1.0μmol/L（100pmol）
Taq聚合酶储存液[SB][2][/SB]	0.5	2U/100μl
总体积（pH8.3）	100.0
石蜡油	50～100.0

扩增条件：94℃60s,37℃60s,72℃120s,共25～30个循环。 注：[1]反应缓冲液[10×]含：100mmol/l Tris-HCl pH8.3(25℃), 15mmol/L KCl, 15mmol/L MgCl[XB]2[/XB], 0.01%(W/V)明胶（Sigma G2500） [2]酶储存缓冲液（-20℃）含：50%甘油，100mmol/l KCl, 20mmol/L Tris-HCl ph8.0 0.1mmol/L EDTA, 1.0mmol/L DTT 200μg/ml明胶 0.5%吐温20，0.5% Nonidet P40 [3][4]引物，1，2：扩增λ-噬菌体基因中500bp的片段 引物1序列：7131～7155（5’）-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG-(3’) 引物2序列：7606～7630（5’）-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-(3’) 注意（3’）端有2个bp互补故易生成50bp的双体