三、应用地高辛标记rRNA探针的电镜原位杂交技术

[b]（一）基本原理[/b] 在地高辛标记核酸探针广泛用于光镜水平的原位杂交试验并获极为满意的结果后，科学工作者试图将其应用于电镜水平。其基本原理和生物素标记核酸探针-PA-Gold电镜杂交技术的基本原理相似，首先利用地高辛修饰核酸探针，与细胞或组织进行杂交，再用抗地高辛抗血清相连胶体金与之结合，进行细胞或组织特异核苷酸的超威结构定位。为增强金的显示效应，可用银加强法增强金粒的显示效应。 [b]（二）基本操作方法（Fischer D et al, 1992）[/b] 1．组织处理 （1）固定：固定剂采用4%多聚甲醛（PFA，用PBS配制）加0.5%戊二醛（GA），保存在4℃。作者采取浸入法，即取大鼠肝脏放入冷固定剂中（4%PFA，不含GA），切成1mm[SB]3[/SB]左右的小方块。修整好的组织块移入另一玻皿中，内盛有4%PFA和0.5%GA,固定2h。 （2）PBS（4℃）漂洗3～5min。 （3）脱水 时间乙醇浓度温度 2×15min　30%4℃ 30min 30%4℃ 30min 50%　-20℃ 2×30min　 70%，90%，96%，100% -20℃ 注意勿使酒精挥发致使组织干燥。 （4）浸透和包埋（Carlemalarm et al, 1989）：由于K4M包埋剂有挥发性，因此，此步操作者必须带手套，在通风柜中进行，注意K4M包埋剂不要靠近O[XB]2[/XB]，一切在低温下进行，最好设有恒低温的冷柜。 ①Lowcryl K4M配方 1）交联剂A　 2g 2）单体B 13g 3）引发剂0.075g 混合1)，2)后，再加“3）”轻搅匀，混匀后置于-20℃。 ②浸透（infiltration），在-20℃进行 时间液体 1h100%乙醇：K4M（1：1，V/V） 2×1h　K4M 过夜 K4M 2×3h K4M ③包埋： 先将胶囊冷却，滴入几滴K4M，然后每个胶囊内放入一个组织块，以K4M充满胶囊，在室温放置30min，使包埋剂中气泡逸出。然后置于0℃-40℃之间，利用紫外线灯360nm波长照射5天，温度必须保存恒定。然后移至室温使温度回升，胶囊变硬。 ④切片：由于胶囊是透明的，包埋在内的肝组织很容易识别。修块后进行切片，由于K4M是亲水性的，在切片过程中注意组织块表面一定不要让水浸湿，用200个网眼的镍网覆以For－mvar膜和碳膜捞取切片，空气干燥备用于杂交。 2．探针准备rRNA探针以Dig-UTP标记，注意探针不宜过长，否则影响对组织的穿透性。如过长，可事先用第二十章　介绍的探针水解法处理。 3．杂交本步骤均在湿盒内进行，将杂交液滴滴于蜡膜上，将镍网载有切片面覆于液滴上，在65℃杂交至少3h。杂交液含：5×SSC，0.1mg/ml tRNA,Dig-UTP反意探针10ng/μl(et 1×SSC配，含150mmol/L NaCl, 15mmol/L醋酸钠)。 4．杂交后漂洗在室温用2×SSC漂洗3×5min，然后用PBST（PBS,0.1%Tween）漂洗2×10min。 5．显示 ①以PBST加BT封闭（BT配方：PBST，1%BSA）孵育15min。 ②应用抗地高辛抗体结合直径1mm的金粒，以PBST加BG稀释为1：30，室温孵育1h。 ③以PBST漂洗3×5min。 ④以带笔尖嘴软塑料壶冲洗6×15min。 ⑤以银增强法，在暗室中孵育于显影液：促进液（Enhancer）1：1,4～20min。 ⑥重复④。 ⑦以2%醋酸铀（4min），枸缘酸铅1min染色，漂洗，空气干燥。 ⑧电镜观察。