三、利用ISHH技术对肿瘤或癌前组织的细胞间期染色体铺片进行研究

[b]（一）基本原理[/b] 在恶性的或癌前病变的组织，染色体组含量与结构的畸变在部分病例中与疾病的预后相一致。由于染色体基因的变化可能导致肿瘤的发生与进展，利用一些技术预测这些遗传物质的变化可为恶性肿瘤的检测及了解其进展和预后提供资料。流式细胞计（FCM）和染色体组型，即核型分析（karyothping analyses）等技术曾被用于这个领域的研究。FCM可测定肿瘤细胞DNA的含量，但它不能显示特异性染色体的结构异常，而且对微量的DNA含量改变难以检测。核型分析可以显示染色体结构和含量的变化，但要分析肿瘤细胞的核型只有在细胞培养以后。细胞培养时细胞的高度分裂指数和细胞的生长会导致染色体物质的丢失，而且核型分析不能显示特异性DNA探针的原位杂交技术，能够检测在细胞分裂间期细胞核内染色体数量和结构的异常变化。因此，这项技术又被称为“间期细胞遗传学分析法（Interphase Cytogenetics Analysis, ICA）。间期细胞遗传学的基本原理是利用合成的特异性DNA探针，标记以同位素、生物素、地高辛或荧光素，对外周血、肿瘤细胞或癌前组织的离散培养细胞的染色体铺片或切片进行DNA-DNA原位杂交，其杂交定位以荧光法、放射自显影或免疫组化法显示。目前ICA已广泛应用于生前诊断、肿瘤组织活检材料的诊断和基因异常的诊断。在肿瘤细胞方面，在乳腺癌，神经系统肿瘤、睾丸肿瘤，妇科肿瘤和膀胱肿瘤等均有实验报告。现已能提供的DNA探针有染色体1，7，8，9，10，15，16，17，18和性染色体X、Y，以及识别一些染色体特征性部位如着丝点（centromeric region）、染色体端极区（telomere region）的特异性重复靶核苷序列和随体的DNA探针，多数为合成的寡核苷酸探针，在应用上采取ISHH和FCM以及免疫组化相结合（有时还结合核型分析）的综合研究法（图21-2），也可用多种标记物显示不同颜色或不同标记在一张切片上同时显示多个染色体的结构或DNA含量异常，如异硫氰酸荧光素（FITC）和罗丹明200结合，前者显示黄绿色，后者显示红色，ABC-DAB显示法与地高辛-碱性磷酸酶系统相结合，前者反应物为棕色，后者为紫蓝色。这种联合应用法又叫多靶点原位杂交法（multiple-target ISH）。 [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/shiyongmianyixibaoyuhesuan/shiyongmianyixibaoyuhesuan110.jpg[alt]肿瘤组织处理流程图 [/alt][/img] 图21-2 肿瘤组织处理流程图 [b]（二）基本操作方法[/b] 1．玻片与组织前处理 （1）肿瘤细胞混悬液的制备：新鲜的从活检或外科手术或尸检获得的材料建议按图21-2的流程处理进行综合研究。用以制作细胞混悬液的组织在处理前可保存于液氮内。组织块在玻皿中切碎或用细胞打碎机打碎，用100μm孔直径的尼龙网过滤器滤过，固定在70%乙醇，-20℃，如保存于-39℃可保存数月至数年。 （2）分离的细胞由于表面有细胞质的覆盖，在荧光显微镜下会显示强烈的自动荧光，从而掩盖了ISHH的信号。可采取下列两种方法移除覆盖的细胞质； ①乙醇固定后的细胞，应用以前在新鲜制备的甲醇/醋酸（3：1）固定液内0℃，5min。滴2～3滴固定后的细胞混悬液于涂有粘附剂的载片上，空气干燥，然后快速浸入70%醋酸内10～60s。应用蒸馏水洗，在100%乙醇内脱水，空气干燥。 ②应用胃蛋白酶蛋白水解作用。加5μl细胞混悬液于载片上，空气干燥30min或在80℃烤箱中干燥。胃蛋白酶（2500～3500单位/mg蛋白质，Sigma,USA）应用0.01mol/L HCl稀释至50～400μg/ml，10min 37℃；再用0.03% H[XB]2[/XB]O[XB]2[/XB]和PBS漂洗，以4%多聚甲醛固定，0℃，5min；载片脱水，空气干燥，在80℃加热变性30min。这个方法较①更好，能移除蛋白质、暴露核DNA和有助于探针的穿透，最重要的能较好的保持形态学的结构，以利于ISHH的荧光信号的显示。应用①法，细胞经常呈扁盘状，而且细胞质的自动荧光未完全消失，影响ISHH荧光信号的显示，但实验表明，必须严格掌握胃蛋白酶的浓度，过低，由于细胞质的覆盖，基因拷贝数会减低，而过高浓度的胃蛋白酶会导致过度消化影响细胞的形态结构。 （3）组织切片处理 ①冷冻切片：切片厚5μm，放置有粘附剂的载片上，空气干燥，固定在4%多聚甲醛-PBS溶液，0℃，15min。固定后以PBS和0.01n HCl漂洗，以胃蛋白酶（20～100μg/ml，用0.01N HCl配制），37℃，30min，PBS漂洗2×5min，在4%多聚甲醛内固定15min（0℃），PBS洗2×5min，系列等级乙醇脱水，空气干燥。杂交前，在80℃加热30min使之变性。 ②石蜡切片：切片厚5μm，漂洗在40℃温水中，捞片于有粘附剂的载片上，空气干燥，56℃加热1～16h，二甲苯脱蜡2×3min甲醇冲洗2×5min。应用1%H[XB]2[/XB]O[XB]2[/XB]（用甲醇配）溶液封闭内源性过氧化物酶活性。以甲醇冲洗，空气干燥，以胃蛋白酶（4mg/ml,用0.2n HCl配）37℃ 30min。消化后，载片以PBS冲洗。在杂交前，载片孵育于1%甘氨酸溶液-PBS中15min，以PBS冲洗和系列酒精脱水，空气干燥。载片在80℃孵育30min使之变性。 2．杂交本实验的杂交液略区别于其它实验，否则染色体1号和18号的DNA探针不仅结合1号和18号染色体，还会同时结合染色体9，6，13，21。杂交液配方： 甲酰胺 60%（V/V，2×SSC配，pH5.0） 鲱鱼精子DNA 1μg/μl 余与一般杂交液配制相同 对多靶点ISHH，须另加入1mmol/L KCN入杂交液，每张载片加5μl的含特异性DNA探针（2.5ng/μl）的杂交液，以盖片覆盖，四周用橡皮泥封固，先在80℃热板上5～10min使DNA变性，细胞混悬液制片变性时间只需2.5min，然后在37℃杂交，孵育过夜。 3．杂交后漂洗同本节　（二）杂交后漂洗步骤。 4．显示步骤根据标记物的种类（同位素、荧光素、生物素或地高辛）分别进行显示（与第二十章　中叙述相同）。 5．结果在光镜下可见染色体结构的改变，如在膀胱肿瘤细胞，其DNA含量经FCM显示高于正常组织1倍，在双靶ISHH显示载片上，可见肿瘤细胞间期核内，1号染色体为3倍体，而18号染色体为2倍体。在肿瘤细胞内应用双重靶点或多重靶点ISHH技术可见细胞间期核内多个染色体的众多畸变相。 ISHH技术作为一项快速与敏感的侦检细胞间期细胞核内染色体畸变的新技术，可结合病理材料的常规组织切片、免疫组化染色和FCM等对病检材料做出早期的、准确的诊断，并对肿瘤的预后与进展等有所了解。本技术成功的关键在于具有特异性的DNA探针和ISHH的侦检程序，比如染色体的拷贝数与肿瘤细胞前处理的方法有关，如移除蛋白质不彻底，就会使侦检到的染色体拷贝数减少。又如在切片上进行细胞间期染色体的ISHH时，常见到一些细胞核碎片呈不同形状的斑点状（在涂片上不会出现此种图像）。对ISHH所获得资料的分析，须经过反复的实践，比如模糊的或分裂的斑点可以是非整倍体（aneuoploidy）的假阳性反应，产生于细胞周期的G[XB]2[/XB]期。