一、PCR与原位杂交细胞化学结合法

自1988年以来On等科学家相继在研究对导致人类免疫缺陷的HIV-1/AIDS病毒DNA进行细胞内定位，以期提高对患者的阳性检出率。在系列研究的基础上，Bagasra及其同事在1990～1993年成功的报告了原位杂交及聚合酶链反应结合法，简称为原位杂交PCR（PCr in situ, PCRIS）。在本书二十二章　中曾介绍了PCR技术，它是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的无细胞克隆技术，基本步骤包括高温变性，低温退火适温延伸三个步骤的反复热循环，其效率可使几个拷贝的模板序列甚至一个DNA分子扩增10[SB]7[/SB]～10[SB]9[/SB]倍。大大提高了DNA的检测率。此法不足之外，在于其不能达到细胞或组织的定位。PCRIS技术的基本的原理是首先利用PCR技术将靶DNA片段扩增，然后用原位杂交细胞或免疫细胞化学技术通过标记的核酸探针与扩增了的DNA进行杂交显示和定位，其敏感性可达到显示单个拷贝基因的信号的程度。Bagasra及其同事们利用这一方法，应用[SB]32[/SB]P和生物素标记的核酸探针分别对导致人体免疫缺陷的HIV-1/AIDS病毒DNA的单个拷贝基因经PCR扩增后在外周血单核细胞内显示成功。就算此法对HIV-1感染患者外周血单核细胞检测的阳性率明显高于用单纯原位杂交技术的检出率，说明其敏感度大于单纯的原位杂交免疫细胞化学技术。其主要实验步骤为将离心沉淀的细胞滴入覆有聚四氟乙烯（teflon coated）的设有三个凹孔的特制玻片（CellLine Associ－ates,Newfield, NJ ,Cat No 10～ 12,12～14mm的孔）的凹孔内，加热105℃90s，然后以2%多聚甲醛-磷酸缓冲液，pH7.4，固定1h，PBS漂洗3min×3。如用生物素标记核酸探针，应用0.3%的H[XB]2[/XB]O[XB]2[/XB]孵育37℃过夜，然后以蛋白酶K溶液（5μg/ml PBS）55℃孵育2h（孵育时间应根据细胞的种类而定），将孵育的载片置于96℃热板上2min，最终以蒸馏水漂洗，空气干燥。在溶液中按PCR技术的需要加入20PM一对应的引物（Primer），15μg PCR混合液含10μmol/l dATP、dCTP、dGTP和dTTP、50mmol/l KCl,10mmol/L Tris(pH8.3),2.5mmol/LMgCl[XB]2[/XB]和10μl Taq多聚酶（lu/μl,Gene Amp Cetuo）。把上述溶液加入左侧二孔中，留一孔加入无引物的PCR混合液作为对照。将载片以22×66mm盖片覆盖，片周以无色指甲油封闭，放入自动的热循环仪（M.J.Re－seasCH,Boston MA）。可改良用铝锡箔纸覆盖于热循环仪表面再放置载片。按94℃/45℃/72℃每个温度1min，30个循环。这温度也可根据引物的GC比例加以调整以求得理想的扩增。也可根据下列公式计算引物的Tm值（Muller & Wold,1989）。 引物Tm=81.5 + 16.6(logM) + 0.41(%GC)–500/n n=引物的长度，mol/L=缓冲液中盐的摩尔数，一般是0.047mol./L 按扩增后，将切片放入100%乙醇3～5min，以锐利刀片移除盖片，将载片放在90℃热板上30s，应用2×SSC漂洗，然后用生物素标记核酸探针进行杂交。载片在95℃热板上5min，然后移入温盒，48℃孵育4h或过夜。次日PBS漂洗，以抗生物素标记FITC抗血清（100μg/ml PBS pH7.2）37℃孵育1h，PBS冲洗，以甘油/PBS溶液封片，荧光显微镜观察。如生物素标记核酸探针的显示系统为过氧化物酶，则应用DAB/H[XB]2[/XB]O[XB]2[/XB]溶液显色，常规光镜观察。这一技术不仅提高了病毒HIV-1的侦检率，而且可用以确定细胞内携带的特殊基因，遗传片段，病毒和肿瘤的侵犯（load）等，是一项颇具广阔应用前景的实验技术。