二、寡核苷酸探针的应用

寡核苷酸探针的优点在于它能根据需要人工用DNA合成仪合成，其长度及分子大小比较一致，可以控制。其长度一般较克隆的DNA片段短。目前，寡核苷酸探针已能成功的为放射性同位素、荧光素、生物素和地高辛所标记，并成功地运用于培养细胞、组织切片和染色体铺片等的原位杂交中。虽然有些科技工作者认为其敏感度不如来自质粒扩增的cRNA或DNA探针，但由于探针制备简便再加之于近年非放射性标记的成功，寡核苷酸探针在生物基础医学及临床学科领域中得到较为广泛的应用。 在原位杂交组织化学中应用寡核苷酸探针，其基本操作要点是相同的，如杂交温度在Tm-25℃，杂交孵育时间以过夜（16h左右）为佳。应用寡核苷酸探针在原位杂交组织化学技术中的成功与否主要决定于探针的设计，使有效配对率增加而错配（mismatch）减少。 [b]（一）地高辛标记寡核苷酸探针的应用[/b] 1．组织处理 （1）冷冻切片：厚10～20μm，贴于事先经清洁处理及涂有粘附剂的切片上。切片保存于-80℃，在应用于杂交实验前，使迅速回升到室温，干燥，固定于3%多聚甲醛-PBS溶液中，pH7.4。PBS漂洗5min×3，孵育在2×SSc10min。 （2）石蜡包埋切片：浸入二甲苯10min移除石蜡，以100%乙醇10min×2，空气干燥10min，从高到低梯度乙醇（95%，80%，70%）1min/每个浓度。PBs 5min×3，孵育在2×SSc 10min。 （3）离心细胞涂片：将细胞先以4%多聚甲醛固定，应用离心沉淀法，将沉淀物涂于有粘附剂的载片上，应用PBS（含5mmol/l MgCl[XB]2[/XB]）5min×3漂洗。在0.1mol/L三乙醇胺含0.25%(V/V)乙酸酐10min。在0.2mol/l Tris –HCl 含（0.1mol/L甘氨酸）pH7.410min。孵育在2×SSc 10min。 2．探针准备35pmol的寡核苷酸（oligo -）探针，3’ 终末标记以地高辛-11–dUTP。 3．预杂交和杂交加约300μl预杂交液（配制法见附录）在每张载片上，室温孵育1h。如为鲱鱼精子DNA，在应用前须在沸水浴中加热10min，而对酵母tRNA可不用加热变性。 （1）应用预杂交液稀释地高辛标记的Oligo-探针，探针理想工作浓度根据于待测核苷酸含量和实践的结果。如对于检测大鼠垂体的前促黑激素（proopiomelanocortin,POMC）mRNA的Oligo –探针，其理想工作浓度为342ng/ml(0.342ng/μl)。 （2）预杂交后以2×SSC漂洗，以吸水纸拭干切片周围水份，加30μl杂交液在切片上，加硅化盖玻片，在37℃过夜。如探针大于36碱基则杂交温度为42℃。次日室温2×SSC液漂洗切片1h，1×SSC漂洗切片1h（室温），0.5×SSc 37℃漂洗半小时，0.5×SSC室温漂洗半小时。 4．地高辛显示（同前）。 [b]（二）同位素标记寡核苷酸探针的应用[/b] 1．组织处理大鼠应用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，经心脏灌注4%多聚甲醛-磷酸缓冲液中，约2h后（也可置于4℃冰箱过夜）取脑浸于同样固定液中加10%蔗糖溶液过夜，4℃。次日恒冷箱切片（-14℃），厚14μm左右，贴于有粘附剂的载片上，37℃或室温干燥以增加切片的粘附性。 2．杂交前处理同本章　第二节　放射性标记cRNA探针一节　。 3．杂交37℃过夜，余细胞同前。 4．杂交后漂洗2×SSc5min×3，1×SSc 1min室温，0.5×SSc55℃15min×2，室温漂洗于0.5×SSc 3min×2。梯度酒精脱水，切片室温干燥。 5．浸核乳胶切片浸入核乳胶，黑盒封闭，在4℃曝光2～3周（视同位素种类），显影，复染，观察。 （第二、三节　中所用试剂配制见附录）。