二、生物素标记cRNA探针在原位杂交组织化学中的应用

（一）光敏生物素标记cRNA探针的应用 以线性质粒DNA为模板合成未加标记物的cRNA探针，使其最终浓度为0.5～1.0μg/μl(500~1000ng/μl),再与等体积的光敏生物素（1μg/μl）混合。在150瓦卤素灯下，距离光源20cm处照射30min。用仲丁醇抽提游离生物素，再用丁醇沉淀回收光敏生物素cRNA探针，将其溶于适量的灭菌双蒸水，用紫外分光亮度计测探针的光密度（详第十九章　），其最佳工作浓度为2μg/ml。 切片的制作、预处理、预杂交、杂交和杂交后冲洗的方法同概述中基本方法一节　。 光敏生物素核酸探针原位杂交组化程序： （1）石蜡切片脱蜡入水后，置0.1mol/l PBS pH7.2冲洗5min；冰冻切片直接入PBS冲洗5min。 （2）0.1mol/l 甘氨酸PBS冲洗5min。 （3）0.4%Trition X-100 PBS 冲洗15min。 （4）蛋白酶K1μg/ml（0.1mol/l Tris –HCl pH8.0, 50mmol/L EDTA配）37℃保温30min。 （5）4%多聚甲醛PBS固定5min。 （6）0.1mol/l PBS冲洗2×3min。 （7）0.25%乙酸酐（0.1mol/l 三乙醇胺配制）10min。 （8）2×SSC冲洗10min（1×SSC：0.15mol/l NaCl, 0.015mol/L 柠檬酸钠）。 （9）取10μl含相应探针的杂交液滴于标本上，如果是cDNA探针则用前将探针于95℃水浴中保温10min，马上放入冰浴中冷却，然后再用。 （10）盖上22×22mm的硅化盖片或合适大小的蜡膜，入温盒43℃保温12～16h。 （11）4×SSC洗脱盖片，并在同一液中37℃漂洗10～30min。 （12）2×SSC（含20μg/mlRNaseA, 适于RNA探针）冲洗30min，37℃。 （13）1×SSC，0.1×SSC,37℃各漂洗10～30min。 （14）0.05mol/l PBS 冲洗4×5min。 （15）3%BSA（0.4%Triton X-100 PBS配）37℃保温30min。 （16）Avidin –AKP(碱性磷酸酶)（1：500～1：100，0.4%Triton X-100 PBS配）室温1～3h。 （17）0.05mol/l PBS冲洗4×5min。 （18）TSM[XB]1[/XB]冲洗2×5min。 （19）TSM[XB]2[/XB]冲洗2×5min。 （20）硝基四氮唑蓝（NBT）0.4%mg/ml 和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸（BCIP）0.2mg/ml混合液显色，室温，暗处3h。 （21）20mmol/l EDTA,pH8.0终止显色。 （22）甘油明胶直接封片。 结果：杂交阳性部位着蓝黑色。 组织处理及预杂交所用器皿需高温消毒，实验者需戴手套。 [b]（三）酶促生物素标记cRNA探针的应用[/b] 基本方法和放射性标记cRNA探针同，所不同的是探针浓度为2.5μg/μl。显示探针反应步骤如下。 （1）用PBS冲洗粘附有切片的载片2×3min。根据情况也可用漂洗法。 （2）将载片浸入0.3%H[XB]2[/XB]O[XB]2[/XB]在PBS或甲醇内30min以封闭内源性过氧化物酶。 （3）PBS冲洗2×3min，用吸水纸拭干切片周围的水份，加入小鼠抗生物素血清1：100和PBS含正常羊血清（1：30），室温1h，或4℃过夜。 （4）PBS彻底冲洗。 （5）载片加生物素化抗小鼠IgG（1：100）30min室温。 （6）PBS彻底冲洗。 （7）应用ABC复合物与等量的1%牛血清白蛋白-PBS液混合孵育1h，室温。 （8）PBS彻底冲洗。 （9）将切片覆以新鲜配制的0.025%DAB溶液，0.02%H[XB]2[/XB]O[XB]2[/XB],孵育3～15min。 （10）水洗，复染，脱水，透明和以甘油/PBS或DPX封固。如需要可用银染，多层ABC或PAP法加强染色效果。