十二、用聚合酶链反应标记高活性DNA探针

聚合酶链反应（PCR）或称体外基因倍增技术，它利用一对位于待扩增的DNA序列两端的取向相对的DNA引物，在DNA聚合酶的介导下，经过多次变性，退火和延伸过程的重复性循环，大量合成靶DNA序列。在标记dNTP存在时，经PCR反应产生的靶DNA片段均参入了标记物，用此法标记的探针标记率高达97.4%。此法重复性好，简便、快速、特异、不要求模板DNA的纯度，可以大量制备。此法有普遍应用价值。 标记方法如下：待标DNA模板1ng,50mmol/L KCl, 10mmol/L Tris-HCl(pH8.4),2.5mmol/LMgCl[XB]2[/XB]dATP、dCTP、dGTP各200μmol/l dTTP150μmol/Ll,Bio-11-dUTP 50μmol./L, 引物各1μmol/L，明胶200μg/ml，2u Taq DAN聚合酶，总反应体积为100μl。混匀后，加石蜡油封顶，94℃和55℃各2min，72℃3min，经25个循环后，可产生5～10μg标记探针，需时仅4h。乙醇沉淀扩增的产物后，溶于100μl TE中，分装-20℃。