四、石蜡包埋组织DNA分析的方法学

由于DNA提取方法的改善和DNA质量的提高，几乎所有基因分析的技术均可用于石蜡包埋组织，但目前分子病理学研究的常用方法是点杂交、Southern印迹杂交和多聚酶链反应（PCR）。 [b]1．点杂交[/b]鉴于包埋组织DNA有一定程度的降解，因而点杂交被认为是一种简便、快速和实用的方法，特别适用于较大样本的筛选。Dyall – smith等（1988）采用未经抽提的蛋白酶消化产物直接点膜，进行点杂交分析，在3周内对200多病例进行筛选，对阳性病例和很难解释的弱阳性斑点，再进行原位杂交等方法作进一步证实。 [b]2．Southern印迹杂交[/b]Southern印迹杂交是经典的基因分析技术，已被广泛地用于基因突变，扩增、重排和丢失等许多方面的研究。石蜡包埋组织的Southern印迹杂交分析有以下几个方面值得注意： （1）当所分析的酶切片段长为300～500bp时，包埋组织DNA杂交信号强度只有相同量标准DNA的10%～85%。信号强度与原始DNA大小呈正相关，最小片段DNA产生最弱的信号。 （2）包埋组织DNA所致的非特异性背景杂交比标准DNA为明显。这种背景杂交的产生可能是由于不包含到分析基因中两个限制性内切酶识别位点的小片段DNA存在。 （3）由于背景杂交明显使得信号模糊，信/噪比缩小。根据Goelz的经验，约有25%石蜡包埋组织不适于作Southern印迹杂交。 （4）某些限制性酶切片段的电泳速度比标准DNA稍迟缓。可能的原因是DNA直接或间接的化学改变使某些限制性酶切位点失活和/或单链DNA存在。 （5）由于小片段DNA的存在，故用作杂交分析的DNA量应适当增加，以增强杂交信号。 [b]3．PCR分析[/b]PCR技术是近年来分子生物学技术的典范，已被广泛地用于分子病理学的各个领域。此技术不但特异性好和敏感性高，而且简便、快速、模板DNA要求不高，特别适于石蜡包埋DNA的分析。 用于PCR扩增的DNA提取比较简单，既使少量DNA样品亦能产生大量特异性DNA拷贝。已被成功地用于各代木乃伊DNA的分析，小至1mm[SB]2[/SB]的HE染色切片提取的DNA亦可获得满意的扩增，并可用于诊断。但是，为了提高PCR的敏感性和可重复性，模板DNA应尽可能地纯化，除去提取物中某些抑制PCR反应的成份。 此外，切片过程中要注意防止污染，以免出现假阳性。 最近，Davis等（1993）对PCR产物进行单链构型多态性（SSCP）分析，可以提高PCR敏感性5倍以上。SSCP分析是应用单链DNA在非变性聚丙酰胺凝胶上电泳，根据序列的不同所产生的构型差异来分析PCr 产物。此分析能检测出小到一个碱基的差异，因而可被广泛地用于研究点突变和基因多态性。 此外，在包埋组织的DNA提取中往往发现有RNA的存在。这些未加任何保护而免受降解的RNA，不可能是完整的序列。然而，此发现提示用福尔马林固定的组织亦可作为Northern印迹杂交分析的可能材料来源。