二、影响DNA提取质量的因素

[b]1．固定剂对DNA的影响[/b]固定剂的类型直接影响提取DNA的质量。目前大多数实验室常用的中性缓冲福尔马林固定的标本，DNA保存完好，可以获得高分子量DNA。Warford等（1988）对甲醛固定过程中DNA变化进行了观察，发现核酸对甲醛反应性可分为两个阶段：①早期出现碱基快速可逆性羟甲基化；②数天后碱基对间核酸与蛋白间缓慢地形成亚甲基交联。DNA提取过程中的蛋白酶K消化，酚/氯仿抽提和纯化等步骤，可以消除由于固定所造成的DNA某些理化性质改变。 bramwell等（1988）发现，甲醛和戊二醛固定可使得DNA产量降低，醋酸甲醇（MAA）可导致DNA明显降解。Michel’s运输保存液或PBS存放组织虽提取DNA纯度高，但产量明显降低。Dubeau等也观察到含苦味酸（Bouin氏液）和含氯化汞的固定液（Zenker,Bs）处理标本不能获得完整的DNA。 乙醇被认为是保存核酸的最佳固定剂。Wu等（1990）用无水乙醇固定标本48h，最长达2年，均可得到中量的高分子DNA。每mm[SB]3[/SB]乙醇固定标本平均DNA产量为26.6μg,高于新鲜标本（19.4μg/mm[SB]3[/SB]）。经限制性内切酶消化后，乙醇固定组织DNA均显示由于重复DNA序列存在所产生的特征性卫星带，说明DNA被完成消化。Southern印迹杂交结果与冰冻组织一致。 Sato 等（1990）用AMex方法处理组织，既可保存许多抗原成分，亦可使大分子量DNA完好无损。其基本方法为：将组织放至4℃丙酮浸透，移至-20℃过夜。然而再用丙酮分别在4[SB]℃[/SB]和室温脱水各15min，苯甲酸透明两次，每次15min，最后60℃真空浸蜡2～3h，石蜡包埋。结果显示，每10mg AMex法处理的湿重组织提高分子量DNA71.4±14.53μg，与新鲜组织产量相当（70.4±13.76μg）。酶切、电泳和杂交反应亦相同于新鲜组织。提示AMex法是一种多用途组织处理技术，可以克服由于DNA降解、高分子量DNA减少和内切酶不完全消化所产生的电泳类型改变，是一种理想的DNA保存方法，特别适用于对形态学、免疫表型和基因改变的相关性分析。 [b]2．固定时间对DNA的影响[/b]固定过程中所发生的组织反应至今尚未被完全更理解，虽然理论上讲室温下福尔马林与DNA几乎不发生反应，但已发现碱基与组蛋白之间的甲基交联。这种福尔马林介导的甲基化直接影响DNA提取的效率。如果事实果真如此，那么固定的时间是一个重要的变异因素。然而，Goelz等没有发现固定时间对DNA提取质量的明显影响。Dubeau等认为组织固定时间太短或太长均会导致DNA的降解。该作者对固定12h到5天不同时间间隔标本的DNA提取显示，随着固定时间的延长，可螺旋化（Spoolable）的高分子量DNA明显减少。固定5天后可螺旋化DNA提取率仅有8%。Warford等也发现单细胞悬液经30min福尔马林固定后，DNA产量减少到30%，由此可见，不同标本对不同固定剂所需的最佳固定时间应摸索选定。根据Dubeau等经验，常规组织固定应在12h以上至110之内。 [b]3．固定温度等其他因素对DNA的影响[/b]核酸与固定剂的反应由反应成分、浓度、酸硷度以及温度等因素的调节　，其中温度效应显得特别重要。室温下DNA双股螺旋链表现为两条由氢键连接在互补多聚核苷酸；加热到65℃时，氢键开始断裂；约90[SB]℃[/SB]时，产生两条单链分子。在此变性状态下，甲醛与酸反应很快，通过羟甲基化作用可抑制DNA冷却后的再复性。 最近，Koshiba等发现福尔马林固定过程中的DNA降解，是由于固定温度高，pH低以及甲酸的存在所致。通过应用缓冲福尔马林和低温下固定（4℃），可以明显改善DNA保存。 酸性环境中DNA的降解已有过深入的研究。一般认为，强酸可导致DNA的完全解聚，而弱酸也能引起一些结构的改变。当pH达到2.5以下时，几乎所有的碱基之间氢键解离，使DNA双链断裂而产生不可逆的变性；随后出现N-糖苷键水解，使嘌呤残基游离；最后，多聚核苷之磷酯键缓慢水解，仅残留具有完整嘧啶的多聚脱氧核糖短臂。上述改变亦受温度或离子强度的影响。加入盐或降低温度可稳定氢键，因而可防止酸性条件下的DNA变性。然而，即使福尔马林被氢氧化钠中和，在室温下DNA亦发生降解，提示福尔马林本身即可降解DNA。福尔马林中DNA降解的机理及其预防有待于进一步研究。 [b]4．组织处理过程[/b]对DNA的影响我们发现，从常规组织处理的蜡块中提取的DNA，其大部分分子量在100bp～1000bp之间，主要分布于100～1500bp，仅约1/3的组织所提取DNA>20kb。这除与固定剂、固定时间等因素有关外，可能的原因还有：①组织从外科切除到固定之间的时间长短不一。当组织未固定或固定不充分时，核酸酶可自由作用；②不同肿瘤中核酸酶的水平不一，其在固定前或固定后均不发挥作用；③蜡块贮存的时间长短不一。虽然从不同贮存时间的蜡块中提取的DNA大小无绝对区别，但新近的蜡块比贮存10年以上的标本所获得的DNA分子量大。可能蜡块中仍存在导致DNA降解的因素。 组织的浸蜡和包埋温度过高或时间过长，均可导致DNA变性，而产生单链DNA片段。单链DNA不能被限制性内切酶所消化，可导致电泳时泳动速率变慢。