（四）液相核酸分子杂交类型

1． （1）HAP吸附杂交：羟基磷灰石（HAP）层析或吸附是液相杂交中最早使用的方法。在液相中杂交后，DNA：DNA杂交双链在低盐条件可特异地吸附到HAP上。通过离心使吸附有核酸双链的HAP沉淀，再用缓冲液离心漂洗几次HAP，然后将HAP置于计数器上进行放射性计数。 （2）亲合吸附杂交：生物素标记DNA探针与溶液中过量的靶RNA杂交，杂交物吸附到酰化亲合素包被的固相支持物（如小球）上，用特异性抗DNA：RNA杂交物的酶标单克隆抗体与固相支持物上的杂交物反应，加入酶显色底物，这个系统可快速（2h）检测RNA。 （3）磁珠吸附杂交：Gen– probe公司最近应用吖啶翁酯（acridinium ester）标记DNA探针，这种试剂可用更敏感的化学发光来检测。探针和靶杂交后，杂交物可特异地吸附在磁化的有孔小珠（阳离子磁化微球体上）。溶液中的磁性小珠可用磁铁吸出，经过简单的漂洗步骤，吸附探针的小珠可用化学发光测定。 2．发光液相杂交 （1）能量传递法：Heller等设计用两个紧接的探针，一个探针的一端用化学发光基团（供体）标记，另一个探针的一端用荧光物质标记，并且这两个探针靠得很近。两个靠得很近的探针用不同的物质标记（标记光发射），当探针与特异的靶杂交后，这些标记物靠得很近。一种标记物发射的光被另一种标记物吸收，并重新发出不同波长的光，调节　检测器使自动记录第二次发射光的波长。只有在两个探针分子靠得近时，才能产生受激发光，因此这种方法具有较好的特异性。 （2）吖啶翁酯标记法：吖啶翁酯标记探针与靶核酸杂交后，未杂交的标记探针分子上的吖啶翁酯可以用专门的方法选择性除去，所以杂交探针的化学发光是与靶核酸的量成比例的。该法的缺点是检测的敏感度低（约1ng的靶核酸），仅适用于检测扩增的靶序列，如rRNA或PCR扩增产物。 3．液相夹心杂交 （1）亲合杂交：在靶核酸存在下，两个探针与靶杂交，形成夹心结构，杂交完成后，杂交物可移到新的管或凹孔中，在其中杂交物上的吸附探针可结合到固相支持物上，而杂交物上的检测探针可产生检测信号。用生物素标记吸附探针，用[SB]125[/SB]I标记检测探针，这个系统的敏感性可检测出4×10[SB]6[/SB]靶分子。该试验保持了固相夹心杂交的高度特异性。 （2）采用多组合成探针和化学发光检测：第一类探针是未标记的检测探针和液相吸附探针，它们有50个碱基长，其中含有30个细菌特异序列碱基和20个碱基的单链长尾；第二类探针是固相吸附探针，它可吸附在小珠或微孔板上。未标记检测探针的单链长尾用于结合扩增多个标记探针，液相吸附探针和靶杂交物从溶液中分离并固定在小珠或微板上，典型的试验可用25个不同的检测探针和10个不同的吸附探针。第一个标记检测探针上附着很多酶（碱性磷酸酶或过氧化物酶）可实现未标记检测探针的扩增。使用化学发光酶的底物比用显色反应酶的底物更敏感。这个杂交方法已用于乙肝病毒、沙眼衣原体、淋球菌以及质粒抗性的检测，敏感性达到能检测5×10[SB]4[/SB]双链DNA分子。 4．复性速率液相分子杂交这个方法的原理是细菌等原核生物的基因组DNA通常不包含重复顺序。它们在液相中复性（杂交）时，同源DNA比异源DNA的复性速度要快。同源程度越高，复性速率和杂交率越快。利用这个特点，可以通过分光光度计直接测定变性DNA在一定条件下的复性速率，进而用理论推导的数学公式来计算DNA-DNA之间的杂交（结合）度。