(二)cDNA探针

cDNA(complementary DNA)是指互补于mRNA的DNA分子。cDNA是由RNA经一种称为逆转录酶(reverse transcriptase)的DNA聚合酶催化产生的,这种逆录酶是Temin等在70年代初研究致癌RNA病毒时发现的。该酶以RNA为模板,根据碱基配对原则,按照RNA的核苷酸顺序合成DNA(其中U与A配对)。这一途径与一般遗传信息流的方向相反,故称反向转录或逆转录。携带逆转录酶的病毒侵入宿主细胞后,病毒RNA在逆转录酶的催化下转化成双链cDNA,并进而整合人宿主细胞染色体DNA分子,随宿主细胞DNA复制同时复制。这种整合的病毒基因组称为原病毒。在静止状态下,可被复制多代,但不被表达,故无毒性。一旦因某种因素刺激而被活化,则该病毒大量复制,如其带有癌基因,还可能诱发细胞癌变,后来发现逆转录酶不仅普遍存在于RNA病毒中,而且哺乳动物的胚胎细胞和正在分裂的淋巴细胞也含有逆转录酶。逆转录酶的作用是以dNTP为底物,RNA为模板,tRNA(主要是色氨酸tRNA)为引物,在Trna3’-OH末端上,5’-3’方向,合成与RNA互补的DNA单链,称为互补DNA(cDNA),单链cDNA与模板RNA形成RNA-DNA杂交体。随后在逆转录酶的RNase H活性作用下,将RNA链水解成小片段。cDNA单链的3’末端回折形成一个小引物末端,逆转录酶又以第一条cDNA链为模板再合成第二第cDNA链,至此,完成逆转录全过程,合成双链cDNA。 逆转录现在已成为一项重要的分子生物学技术,广泛用于基因的克隆和表达。从逆转录病毒中提取的逆转录酶已商品化,最常用的有AMV逆转录酶。利用真核Mrna3’末端存在一段聚腺苷酸尾,可以合成一段寡聚胸苷酸(oligo(dT))用作引物,在逆转录酶催化下合成互补于mRNA的cRNA链,然后再用RNase H将mRNA消化掉,再加入大肠杆菌的DNA聚合酶I催化合成另一条DNA链,即完成了从mRNA到双链DNA的逆转录过程。 所得到的双链cDNA分子经S1核酸酶切平两端后接一个有限制酶切点的接头(linker),再经特定的限制酶消化产生粘性末端,即可与含互补末端的载体进行连接。常用的克隆载体是λ噬菌体DNA,如λgt,EMBL和Charon系列等。用这类载体可以得到包含104以上的转化子的文库,再经前面介绍的筛选方法筛选特定基因克隆。用这种技术获得的DNA探针不含有内含子序列。因此尤其适用于基因表达的检测。