一、DNA变性

DNA变性是指双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成单链无规则线团，因而发生性质改变（如粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加等），称为DNA变性。加热、改变DNA溶液的pH、或受有机溶剂（如乙醇、尿素、甲酰胺及丙酰胺等）等理化因素的影响，均可使DNA变性。 通常，可利用DNA变性后波长260nm处紫外吸收的变化追踪变性过程。因为DNA在260nm处有最大吸收值这一特征是由于含有碱基组成的缘故，在DNA双螺旋结构模型中碱基藏于内侧，变性时由于双螺旋解开，于是碱基外露，260nm紫外吸收值因而增加，这一现象称为增色效应（hyperchromic effect）。见图18-2。 [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/shiyongmianyixibaoyuhesuan/shiyongmianyixibaoyuhesuan091.jpg[alt]DNA的增色反应 [/alt][/img] 图18-2 DNA的增色反应 如果升高温度使DNA变性，以温度对紫外吸收作图，可得到一条曲线，称为溶解曲线（见图18-3），由图可见当温度升高到一定范围时，DNA溶液在260nm处的吸光度突然明显上升至最高值，随后即使温度继续升高，其吸光度也无明显变化。由此说明DNA变性是在一个很窄的温度范围内发生，增色效应是爆发式的。从而也说明当达到一定温度时，DNA双螺旋几乎是同时解开的。通常人们把50%DNA分子发生变性的温度称为变性温度（即熔解曲线中点对应的温度），由于这一现象和结晶的融解相类似，故又称融点或融解温度（melting temperature, Tm）。因此Tm是指消光值上升到最大消光值一半时的温度。 [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/shiyongmianyixibaoyuhesuan/shiyongmianyixibaoyuhesuan092.jpg[alt]DNA的Tm值 [/alt][/img] 图18-3 DNA的Tm值 综上所述，Tm值和增色效应是目前描述DNA特性所常用的两个量。假定一个DNA大分子最初全部是双螺旋结构，在热变性后消光系数上升30%以上；如果DNA原先局部就处于单链状态（例如在分子末端），则变性后上升较少。增色效应的大小是DNA性质的一个简单指标，与分子量无关。Tm不是一个固定的数值，它与很多因素有关：pH、离子强度和DNA的碱基比例。随着溶剂内离子强度上升，Tm值也随着增大。在某一离子强度（～10[SB]-3[/SB]M）以下，无需加热就使溶于其中的DNA出现不可逆变性。与A-T碱基配对比较，DNA双螺旋内的G-C配对更为牢固。在相同条件下，DNA内G-C配对含量高，其Tm值也高。 假定在一个双链DNA分子内某些片段含有较多G-C碱基对，根据它们局部Tm值差，用电子显微镜就可以观察和测量到这些片段，如在DNA某一片段内含有较多的A-T碱基对，在某一个温度时就可能出现双链解离的现象。但在同一温度下，含G-C对较多部分仍然保持双链结构。这是一种非常有用的技术。 DNA的Tm值与以下因素有关： （1）DNA的均一性：均一DNA如病毒DNA，解链发生在很窄的范围内，而不均一的DNA如动物细胞NDA其Tm值的范围则较宽。 （2）DNA分子中（G+C）的含量：一定条件下DNA的Tm值，由G+C含量所决定，因为G+C之间有3个氢链，因此G+C含量较高的DNA，Tm值较高，二者的关系可用以下经验式表示： %（G+C）=（Tm-63.0）×2.44 实验表明DNA分子中（G+C）克分子含量百分比的大小与Tm值的高低呈直线关系，见图18-4。 [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/shiyongmianyixibaoyuhesuan/shiyongmianyixibaoyuhesuan093.jpg[alt]DNA和Tm值与G-C含量的关系 [/alt][/img] 图18-4 DNA和Tm值与G-C含量的关系 （3）溶剂的性质：Tm不仅与DNA本身性质有关，而且与溶液的条件有关，通常溶液的离子强度较低时，Tm值较低，融点范围也较宽，离子强度增高时，Tm值长高，融点范围也变窄。因此，DNA制剂不应保存在离子强度过低的溶液中，一般保存在1mol/l NaCl溶液中较稳定。