四、病毒计数

五、病毒的快速诊断 免疫细胞化学为病毒感染性疾病的快速诊断开创了一个广阔的道路（参见表16-2），最先用免疫荧光法作流感病毒快速诊断，证明有较高的特异性。随后，对流行性乙型脑炎，脊髓灰白质炎、呼吸道和肺炎腺病毒、疱疹病毒等进行了临床快速诊断，提高了诊治效果。近年，利用免疫细胞化学方法检测EB病毒IgA抗体诊断鼻咽癌取得突破性成果，对于早期诊治鼻咽癌作出了重大贡献。在早期诊断流行性出血热方面，免疫细胞化学方法更显示了其优越性，利用感染流行性出血热病毒的细胞培养标本，可以在发病的早期查出IgM抗体，作出早期快速诊断。检测患者血清中的抗体和效价，更有利于病毒感染性疾病的防治，也可直接检查病变中的病毒。 表16-2 免疫细胞化学在病毒学的应用

疾病	检出对象	标本	方法	敏感性	特异性	意义
各种立克次体病	抗体	血清	IIF	高	高	诊断
	抗原	病变组织	DIF	中～高	高	流病
						调查
呼吸道病毒感染	抗（IgM，IgG，IgA）病毒（RS，流感甲、乙副流感1，3，4，6b，腺病毒组、麻疹、腮腺炎、风疹）	血清、脑脊液、其它体液、鼻咽部洗液、呼吸道分泌物、病变组织、活检及尸检材料、组织培养材料	IIF	高	高	诊断
			IIF	中～高	中～高	同上
			DIF			诊断
病毒性肝炎	HBsAg	血清、组织	DIF	高	高	辅诊
HBV			IIF
	HBcAg	血清、组织	IIF	高	高	辅诊
			DIF
HAV	HA Ag	肝活检	IIF	高	高	研究
疱疹病毒感染
单纯疱疹	抗原	皮肤刮屑	IIF	高	高	诊断
巨细胞病毒感染	抗体	血清	IIF	高	高	诊断
			ACIF
带状疱疹	抗体	血清	IIF ACIF	高	高	辅诊
EB病毒感染	抗体	血清	IIF	高	低	辅诊
狂犬病	抗原	犬脑	DIF	高	高	受伤人确诊
	抗体	血清	IIF	中	中	诊断
虫媒病毒感染	抗体	血清	IIF	高	高	诊断和流
马脑炎						病调查
登革、黄热圣路易脑炎	抗体	血清	IIF	高	中	同上
乙型脑炎	抗体	血清	IIF	高	高	诊断
无菌性脑炎	抗体	血清	IIF	高	高	诊断
出血热、拉赛热	抗体	血清	IIF	高	高	诊断流病
AIDS病毒	抗体	血清	IIF	高	高	调查

注：ACIF：抗补体免疫荧光法：DIF：直接免疫荧光；IIF：间接免疫荧光（引自：黄策：免疫荧光和荧光免疫，1983） 作者等用免疫荧光和ABC法在人肾组织中发现了流行性出血热病毒抗原。 免疫荧光细胞化学技术为病毒感染的快速诊断开辟了一条很有希望的道路，一方面可用于病原体检出，另一方面可用于抗体的检出。 [b]（一）病毒的检查[/b] 1．原发感染材料的直接制片检查取病人或感染动物的末梢血液、尿、大便、脊髓液，咽喉鼻腔拭子、含嗽液、表皮病变渗出物、以及尸检材料等。进行直接法免疫荧光染色检查。可在2～3h以内得出初步结果。 2．组织培养物检查将取自病人或感染动物的材料感染培养细胞，待病毒在细胞内发育繁殖到一定程度后才能作免疫荧光检出，一般需10h以上。 3．接种动物感染材料检查将取自病人的感染材料接种实验动物如小鼠、鸡胚，使其发病，然后以免疫细胞化学方法检查实验动物的各种感染标本。 [b]（二）抗体的检查[/b] 用已知病毒感染的细胞培养物为抗原，现酮固定10min，用病人待检血清与抗原反应20min，再用抗人IgG和IgM荧光抗体分别染色30min，按常规洗涤、裱封、镜检。一般需在发病过程中，前后两次检查（急性期和恢复期各一次），证明被检血清的染色强度有4倍以升高时，方能确定诊断。它比常规血清学方法操作简便，对有些病毒感染敏感性较高。张新生等利用金黄色葡萄球菌表面蛋白A（SPA）能与IgG的Fc段结合这一特点，用全菌体作为标记靶吸附病毒，形成花环状结构，再用2%磷钨酸负染色后在电镜下观察，操作简便，易于推广。 [b]（三）常见病毒的快速检查方法[/b] 1．乙型肝炎病毒抗原的快速检查方法作者用免疫荧光间接法，PAP法和ABC法分别对人活体肝穿刺组织和尸检的肝炎、肝硬化和肝癌组织、先用10%甲醛固定、石蜡包埋切片，进行了乙型肝炎病毒HBsAg、HBcAg 和HbcAb的检查，在肝细胞、胆管上皮细胞和癌细胞内发现了这些抗原或抗体，对诊断和发病机理研究有重要意义。 2．狂犬病毒的快速检查方法可直接检查活检和尸检材料或查角膜印片中的狂犬病毒抗原，用直接法最成功。也可用间接法检测IgM抗体进行早期诊断。最好用免疫荧光法。 3．疱疹病毒的快速检查方法疱疹病毒（HSV）的抗原用直接免疫荧光检查，常取眼结合膜细胞，皮肤刮片，活检和尸检材料。 4．巨细胞病毒的快速检查方法用抗补体荧光抗体方法作此病毒抗原的特异性检查，常取尿沉渣中的细胞涂片标本进行检查。 5．流感病毒的快速检查方法最早用免疫荧光法检查流感病毒，一般采用直接法检查鼻咽部脱落细胞涂片中的病毒抗原。也可用间接法检测抗体，必须使用单价特异性羊抗人IgG荧光抗体，以避免与上皮细胞上的IgA发生非特异性荧光。 6．麻疹病毒的快速检查方法检查麻疹病人出疹前后的鼻咽部分泌物和眼结合膜中的细胞可快速检出病毒抗原。也可用尿沉渣细胞标本直接法检出抗原。用间接免疫荧光法可检出病毒抗体作快速诊断。 7．流行性出血热病毒快速检查方法直接法检查白细胞中的抗原，单克隆抗体可制备高效价的荧光抗体。用间接法可快速检出病人IgM抗体，对病人进行早期诊断是我国的创新，世界卫生组织向各国推荐。 8．爱滋病病毒抗体免疫荧光检查方法目前常用以下方法检查患者血清中的AIDS病毒抗体，对高危人群和可疑患者进行病毒抗体检查具有重要的意义。 抗原片：将AIDS病毒感染的Hu-T-78细胞用PBS制成悬液，滴于玻片上，吹干，丙酮固定，装入塑料袋中，密封，-40[SB]℃[/SB]保存。阴性对照用Hu-T-78细胞，同上法滴片处理。 间接免疫荧光检查法。 （1）先将待检血清用PBS作1：16稀释，取30μl滴加在抗原片上，放入湿盒，37[SB]。[/SB]C30min。 （2）用0.01mol/L,PBSPh7.0洗涤2次，每次3min。 （3）滴抗人IgG荧光抗体，湿盒37℃3min。 （4）PBS洗2次，每次3min。 （5）缓冲甘油封片，荧光显微镜检查。 结果：抗原片细胞浆内出现弥散荧光，阴性对照无荧光。 9．其他病毒的快速检查方法腺病，带状疱疹病毒，付流感病毒，流行性腮腺炎病毒，呼吸道细胞病毒，风疹病毒，肠道病毒，乙脑病毒，森林脑炎病毒，登革热病毒等已有报告用免疫荧光法检查抗原或抗体作快速诊断。