十、梅毒螺旋体的检查法

免疫荧光细胞化学应用于梅毒血清学诊断有很多文献报道。70年代应用PAP法又将敏感性提高了许多倍，此法已作为梅毒诊断的常规方法。用间接免疫荧光法可PAP法，取已知梅毒螺旋体作抗原，检查病人血清中的特异性抗体。 [b]（一）抗原制备[/b] 以标准株（如Nicol株）梅毒螺旋体感染家兔睾丸，约1周后待睾丸产生明显炎症，剖腹将睾丸摘除，仔细清除精索、附睾和包膜，然后以灭菌器械将其剪成薄片，置于烧瓶内，加入20ml生理盐水，振荡30min，使螺旋体逸出，2000r/min离心10min以除去组织碎块和血细胞，将上清高速离心（10,000r/min）30min，去上清，沉淀以5ml生理盐水洗涤，再高速离心，洗涤，反复3次以上，以尽可能除去组织成分和家兔球蛋白，最后以pH7.2PBS(内含0.01%硫柳汞或数滴福尔马林以防腐)将沉淀制成敏感毫升约含10，000，000螺旋体的悬液，置4℃保存备用。有效期约半年。 [b]（二）荧光抗体[/b] 用抗人IgG和IgM荧光抗体。为诊断新生儿先天性梅毒，必须用抗人IgM荧光抗体。 所有稀释用PBS 0.1mol/L Na[XB]2[/XB]HPO[XB]4[/XB]-KH[XB]2[/XB]PO[XB]4[/XB],0.15mol/lNaCl Ph7.2含1%Tween-80。 [b]（三）间接免疫荧光染色方法（FIA试验）[/b] 1．定性检查先将待检血清灭活。在载玻片上以白金耳取抗原液涂片，每片涂4个点，在室温中晾干，丙酮固定10min。各点分别加－1：50稀释待检血清；②－1：200稀释阳性血清；③－1：50稀释阴性血清；④－PBS。放入湿盒，在37[SB]℃[/SB]或室温中放置20min，用PBS振荡洗涤10min，再加适当稀释的抗人IgG和IgM荧光抗体，再同上条件下放置20min，水洗，封裱，镜检。结果如①、②荧光阳性，③、④阴性，待检血清即判断为阳性。阳性时梅毒螺旋体呈明亮的黄绿色荧光，亦有人将待检血清稀释1：200作定性检查，这样可排除低稀释时正常人可出现的假阳性反应，此法又称FTA-200试验。 2．滴度测定如定性检查阳性，则被检血清应进一步稀释成1：100，1：200，1：400，1：800，1：1600……以定出染色滴度，滴度疑点以螺旋体发“++”荧光为标准。 [b]（四）荧光梅毒螺旋体抗体吸收试验（Fluorescent treponemal antibody – absorption Test 简称FTA－ABS）[/b] FTA-200试验敏感性较差，有时查不出潜伏期和晚期梅毒。FTA－ABC试验不但敏感性高，而且特异性更好。方法是将非致病性螺旋体Reiter株的培养液于121℃高压加热10min，然后高速离心、沉淀，取其上清浸液作为吸附剂，并用以稀释病人血清（1：5），然后如上法（FTA试验）进行染色检查。 FTA-ABC所用的反复洗涤过的纯梅毒螺旋体抗原，推荐置1.0%清蛋白、0.0375mol/l葡萄糖、0.01mol/L二氯化镁和0.85%氯化钠溶液（用0.1mol/L磷酸钾缓冲液pH6.8配制）中冰冻干燥保存，其中清蛋白起保护剂的作用，葡萄糖可增加折光率，二氯化镁维持螺旋体的形态学，缓冲液稳定pH。 [b]（五）梅毒螺旋体的直接检查法[/b] 取梅毒局部硬结渗出液涂片，用直接法或间接法免疫细胞化学染色，更容易发现隐藏在细胞碎片之间的螺旋体。免疫荧光检出效果和暗视野检一样敏感。如用RB200标记牛清蛋白作初染色，图像更为清晰。