二、消化道全层铺片技术

用消化道切片结合免疫细胞化学染色固然能显示壁内神经丛的神经细胞及纤维。但由于壁内神经丛为扁平的网状结构，欲窥其全貌，则以消化道全层铺片技术进行免疫细胞化学染色效果最佳。消化道全层铺片在英文文献中通常称为whole mount stretch preparation，即整装撕片。即根据消化管壁内神经丛的结构特点，分纵层肌、环层肌、粘膜下层等分层撕开铺片，以暴露不同的壁内神经丛。以肠道为例，简述消化道的分层铺片技术。 动物麻醉后，用Zamboin’s液行主动脉灌注固定，剖腹取任何一段肠管放入上述固定液中4[SB]℃[/SB]下3h，然后移至4%多聚甲醛液固定3h，再移至20%蔗糖4[SB]℃[/SB]过夜，于次日行全层铺片。选择一大小适宜的吸管或玻棒穿入肠管，使其被动扩张，然后用钟表镊在肠系膜附着处沿肠管纵轴划痕，用镊尖沿划痕轻轻剥离分离纵肌层，将剥离的纵肌层放在载玻片上（浆膜面向下）。在解剖显微镜下，用镊尖轻挑去附于神经丛上的环层肌，即得纵、环肌之间的肌间神经丛。再将肠管的粘膜面向外翻套在吸管或玻棒上，用镊子或手术刀反复刮去表面的上皮层，即可获固有层表面的粘膜丛，重刮时刮去表面的粘膜层，即可暴露粘膜下层的粘膜下神经丛。 撕片放入0.1mmol/L的PBS溶液中，等待进行免疫染色。其步骤与切片染色同，只是由于撕片较厚，为增强抗体的穿透性，常于染色前在系列酒精中反复脱水后，再进行免疫染色。一般撕片进行免疫染色地漂浮法为佳，可增加壁内神经丛与抗血清的接触。如撕片数量少，为节　约抗血清也可用载片法，此时载玻片上需涂抹一层粘附剂如铬矾明胶或多聚赖氨酸，以免撕片在染色过程中脱落。