二、溶菌酶的免疫细胞化学染色特点

[b]1．组织固定和加工[/b]用冰冻组织切片可直接进行溶菌酶免疫细胞化学研究。用冷酒精固定，4%福尔马林缓冲液或1.5%戊二醛固定均能进行免疫细胞化学染色。但浸蜡时温度不能超过60[SB]℃[/SB]，载玻片应涂薄层明胶以防组织切片脱落。载片后，组织切片应放在50～56[SB]℃[/SB]的烤箱中干燥但不能放在底层，因烤箱底层温度不均匀。组织切片应避免接触含油类的手和容器。组织块应放在4℃密闭容器内干燥保存。脱蜡一定要完全。 [b]2．染色方法的选择[/b]根据具备的抗体和标记抗体，免疫荧光和免疫酶技术均可采用。间接法、PAP法和ABC等方法均可以选择。大部分报道多采用冷冻切片和ABC染色方法。ABC方法特异性强，敏感性高，非特异性染色少。目前国内已有ABC试剂盒生产。普遍认为国外Vectastain 实验室生产的Vectastain Elite ABC kit试剂盒较好，其敏感性比Vectastain ABC peroxidase kit高5倍。如果加大第一个抗体的浓度，可进行快速染色，整个染色过程只需30min。如果要进行双标记染色，可在DAB显色液作用后组织切片再进行另一种抗体染色，最后在DAB显色液中加氯化镍，使阳性部位显示紫色。与DAB显示红棕色比较，反差明显。 [b]3．ABC染色步骤[/b]叠氮钠能抑制过氧化酶活性，不宜用以稀释ABC试剂盒中的试剂。第一抗体应用0.1%结晶状的牛血清白蛋白溶液稀释。所用缓冲液最好新鲜配制，ABC试剂用玻璃瓶装的蒸馏水稀释，去离子水可能含过氧化酶抑制剂，能降低敏感性，不宜采用。具体步骤是：①新鲜组织冰冻切片后空气干燥或风干10min。②切片用丙酮或95%酒精固定10min后PBS冲洗3次，共10min。（也可先固定，后切片，再清洗）。③在0.3%H[XB]2[/XB]O[XB]2[/XB]甲醇中放置20min后PBS冲洗3次，每次5min。④用正常兔血清稀释孵育20min后，用滤纸吸取过多的血清，并擦干载片中组织周围的液体，但不能使组织干燥，并用彩色笔在组织周围圈画以防抗体液流失。⑤加鼠抗溶菌酶稀释抗血清，在室温下放置30min或在4[SB]℃[/SB]过夜后BPS洗10min。⑥加生物素化的兔抗鼠血清稀释液，在室温下放置30min后PBS洗20min。⑦加稀释好的Vec-tastain Elite ABC试剂盒中的AB混合液（在使用前30min配好），再孵育30min，PBS洗10min。⑧组织切片在含0.1%DAB（1mg/ml）和0.02%H[XB]2[/XB]O[XB]2[/XB]的0.1mol/l pH7.6 Tris缓冲液中反应2～7min，自来水冲洗5min（在显微镜下观察结果，决定反应时间）后甲基绿或苏木精对比染色，脱水和封片，显微镜观察。 [b]4．结果判断[/b]溶菌酶主要分布在腺体细胞胞浆内，其中以潘氏细胞和杯状细胞中最明显，也可以分布在腔面或粘液中。炎性组织中粒性白细胞、巨噬细胞等炎性细胞浸润较多，也有明显着色。但是这些细胞多位于固有层内，即使个别细胞位于上皮层，其形态与腺体细胞不同，容易鉴别。当然，这些阳性细胞需与内源酶引起的着色相鉴别。