二、癌胚抗原的免疫细胞化学染色

[b]1．组织加工[/b]有人提出用冰冻切片进行CEA免疫细胞化学染色。由于非特异性荧光和需要一定设备条件，有人改用福尔马林固定和胰酶消化的方法。从我们的体会看，福尔马林固定后的切片CEA的部分抗原决定簇被遮盖，阳性结果显着受到影响。但是用冷酒精固定后的组织切片，CEA的阳性率明显升高，而且结果仍很清晰。goldenbery等同时进行CEA酶标记组织，而福尔马林固定的组织切片中CEA检出范围为3.0～7.0ng/g组织，酒精固定的组织切片比福尔马林固定者敏感2～3倍。有趣的是我们用酒精固定26个月的切片进行染色，效果仍然很好。说明冷酒精固定法便于进行回顾性研究。虽然酒精固定后组织收缩比较明显，但不影响组织结构及形态，而且可以进行多种抗原的定位研究，操作简单，是值得推荐的一种组织固定方法。冷酒精固定方法和步骤同抗体产生细胞的研究。 [b]2．染色方法的选择[/b]根据实验条件和抗体特点选择染色方法。PAP和ABC技术可以采用，但试剂价格较昂贵，步骤较复杂。我们认为间接荧光或间接酶技术即可获得满意结果。间接酶染色技术步骤如下： （1）冷酒精固定的组织石蜡包埋，组织切片，常规脱蜡后在PBS中放置5min，过一次蒸馏水清除玻片上的沉淀物后风干，加含3%H[XB]2[/XB]O[XB]2[/XB]甲醇一滴在切片上，放置20min后再PBS冲洗3次，过蒸馏水后风干。 （2）加稀释好的兔抗CEA血清（稀释度根据染色工作效价）在37℃湿盒内放置45min。 （3）PBS清洗3次后风干，再加HRP标记物的羊抗兔IgG（稀释度也要根据染色工作效价），37[SB]℃[/SB]湿盒内放置45min。 （4）PBS清洗3次后加新鲜配制的含3%H[XB]2[/XB]O[XB]2[/XB]pH7.6Tris缓冲液（10ml溶液中含二氨基联苯胺5mg）中暗处反应5～8min（边反应边在显微镜下观察），自来水冲洗，用1%甲基绿复染2～5min，再次自来水冲洗，常规脱水、透明和封片，在光镜下观察。 [b]3．阳性结果判断及计数检查[/b]前应当对CEA的分布有一定理性认识，而且用正常结肠组织和阳性组织作对照观察。CEA以三种形式出现在胃肠道组织切片中：①腔面分布。沿腺腔面的胞浆有棕红色酶着色。这是胃粘膜中肠上皮化生腺体、高分化腺癌和正常结肠腺体的CEA分布形式。②胞浆分布。在低分化粘液细胞癌中，CEA多位于胞浆。③粘液分布。在高分化腺癌的腺腔和粘液细胞癌周围的粘液中有CEA着色。 [b]4．腹水免疫细胞化学染色临床上鉴别[/b]良恶性腹水可采用免疫细胞化学技术。抽取200～300ml腹水，离心后取细胞沉淀进行直接涂片、干燥、酒精固定后采用间接荧光染色。具体的方法是：在腹水涂片上加兔抗CEA抗血清（1：25稀释，稀释液为BPS缓冲液），在37[SB]℃[/SB]湿盒内放置45min后BPS冲洗，共10min，再加入FITC标记的羊抗兔IgG（1：20稀释，稀释液为0.1%伊文氏蓝缓冲液），在37℃湿盒内放置45min后，PBS冲洗3次，共10min，用50%甘油封片，荧光显微镜观察。有绿色荧光阳性细胞的片子再进行HE染色，做对照观察和判断。也可以将细胞沉淀物在试管内直接进行间接荧光染色（方法同T淋巴细胞染色）。我们发现，不论采用哪种方法，都可能出现非特异性着色。少数淋巴细胞也能出现荧光或酶着色。其机理尚不清楚，如果采用伊文氏蓝作对比荧光染色，可明显减少非特异性荧光，而且淋巴细胞较小，腺癌细胞较大，有利于进行鉴别诊断。