一、角蛋白

关于角蛋白（Keratin）的分子生物学特性本节　不作详述。考虑到临床病理工作的实际需要，只作扼要介绍。角蛋白是位于细胞内的多基因编码的非水溶性纤维性多肽，它存在于每种上皮细胞之中。到目前，已知人类上皮组织含有19（或更多）角蛋白分子，其中角蛋白Ｉ与最轻者（67kD）相对应。而角蛋白19与最轻者（40KD）相对应。其中亚型2～10被任何上皮所表达，但取决于细胞类型、胚胎发育阶段、细胞分化程度等因素。而最小分子的角蛋白（40kD）是单层上皮的特征，并且是在胚胎时期首先出现的，在肿瘤性上皮细胞中则常常出现。大分子量角蛋白可能是从简单的低分子量角蛋白进化而来。根据角蛋白的等电点、酸碱性及分子量大小，又可分为A（acidic）和B(basic)两大亚族。 [b]（一）角蛋白抗体及其在肿瘤病理学中的应用[/b] 针对角蛋白家族不同成员的多克隆抗血清的敏感性和特异性存在着广泛的差异，很多商品化的抗血清对大分子角蛋白尤为敏感，因此在外科病理学中的诊断价值受到限制。相反，角蛋白的单克隆抗体较多克隆者，在敏感性和特异性方面都有许多优点，并且现在已可获得商品化的单一或混合抗体。角蛋白的单克隆抗体大体上可分为两组：一是广反应组（broadly reac－tive group），它能识别角蛋白家族中许多成员所共有的表位；另一是选择组，它仅识别少数角蛋白成员甚至某一种角蛋白。其中，识别小分子量角蛋白18和19的单克隆抗体在病理诊断中最为有用。 1．广特异性角蛋白单克隆抗体这组单克隆抗体对识别上皮细胞尤其是肿瘤细胞具有高的敏感和特异性。这些抗体包括AE[XB]1[/XB]，AE[XB]3[/XB]，CAM—5.235BHll，UCD/PR10.11c 以及KA[XB]4[/XB]。这些单克隆抗体可以优先识别存在于A和B亚族中的小分子量角蛋白的表位。其中，AE[XB]1[/XB]在不同的固定和染色条件下对角蛋白显示了很高的敏感性和广泛的特异性。因此，特别适合用于区分分化差的癌和非上皮性肿瘤。而CAM-5.2对识别神经内分泌癌优于AE[XB]1[/XB]，这是因为CAM—5.2，UCD/PR10.11和35BH11以其各自理想浓度混合即可。另外，目前已有针对小分子量角蛋白的商品化的单克隆抗体混合物可供选择（MAK—6和AE[XB]1[/XB]/AE[XB]3[/XB]）。这些试剂对鉴别上皮组织肿瘤具有广特异性和很高的敏感性。①广特异性角蛋白单克隆抗体在正常组织的染色。用上述抗体在多数正常的上皮细胞可以获得很强的染色效果，但也存在一些差异。AE[XB]1[/XB]和KA[XB]4[/XB]对皮肤和附件上皮、非角化性复层上皮、单层上皮（如胃肠道等）、泌尿系上皮、分泌性腺体的管道、间皮、乳腺和胸腺上皮可以有很强的染色，但不染正常的肝细胞、唾液腺和胰腺腺泡细胞以及肾小管上皮细胞。这些细胞优先表达角蛋白18，不能被AE[XB]1[/XB]和KA[XB]4[/XB]所识别。相反，CAM—5.2则能识别角蛋白18，可染肝细胞，腺泡细胞和肾小管上皮细胞，但不能染正常的表皮细胞。而AE[XB]3[/XB]单抗不论在冰冻切片，还是在酒精固定、石蜡包埋的切片上，都可以染所有正常的上皮细胞，但在福尔马林固定的组织阳性比例下降。因此，AE[XB]3[/XB]可望成为识别所有角蛋白作为上皮组织起源的通用探针。②广特异性角蛋白单克隆抗体对肿瘤的染色。如前所述，虽然AE[XB]1[/XB]和KA[XB]4[/XB]对正常肝细胞和肾小管上皮细胞呈阴性染色结果，但很多肝细胞肝癌和肾癌却可微弱或局灶性表达它们识别的表位，这可能是肿瘤转化过程中抗原改变所致。角蛋白类型的变异表达在非肿瘤性病变的肝细胞中亦可出现。已经证明，Mallory 小体即是由在正常肝细胞所不能测出的角蛋白所组成，AE[XB]1[/XB]和KA[XB]4[/XB]对可将其染为阳性。 应当指出的是，广反应性角蛋白单克隆抗体与上皮组织肿瘤不起反应，但在上皮样肉瘤和滑膜肉瘤例外。另一个中胚层来源的肿瘤即间皮瘤，仅约有1%的病例可表达上皮特征。 2．广特异性角蛋白单克隆抗体在诊断中的应用 （1）未分化癌。使用上述抗体可以成功区分未分化癌与大细胞淋巴瘤和无黑色素性黑色素瘤。此时，最好同时使用黑色素瘤和白细胞标记物以避免阴性结果。同时，为了达到对未分化肿瘤精确诊断的目的，最好使用一组单克隆抗体，包括波形蛋白、白细胞共同抗原（LCA）、S—100以及黑色素瘤特异性抗原HMB—45的单克隆或多克隆抗体。值得指出的是，约有10%的大细胞淋巴瘤会因福尔马林固定而不能染出LCA，尤其是固定时间过长时，这在应用免疫细胞化学鉴别诊断时应当考虑。 （2）腺癌。所有腺癌，不论其细胞起源如何，均可表达用广反应性角蛋白单克隆抗体易于测出角蛋白。因此，上述抗体甚至可作为识别某些腺癌微转移灶，在正常时不含角蛋白的器官或组织，如淋巴结和骨髓中，甚至易于识别出单个转移性肿瘤细胞。 （3）胸腺瘤。当活检标本很小时，鉴别发生于纵膈的胸腺瘤和淋巴瘤有时相当困难。这种情况下，使用广反应性角蛋白单克隆抗体可以明确肿瘤细胞的上皮性质。在胸腺瘤，即便是淋巴细胞为主型，免疫细胞化学染色亦可揭示均匀分布于肿瘤之中的大量含有角蛋白的细胞。相反，累及胸腺的淋巴瘤为阴性结果，但偶可发现残存的胸腺组织灶。 （4）生殖细胞肿瘤。所有生殖细胞肿瘤，除精原细胞瘤外，均表达角蛋白。因此，在病理工作中遇到难以鉴别的间变性精原细胞瘤胚胎性癌时，使用广反应角蛋白单克隆抗体是有帮助的。因在胚胎性癌，总会有些肿瘤细胞表达角蛋白。在典型的精原细胞瘤，有时虽然可看到含有角蛋白的滋养层型细胞，但这种机会是很偶然的。 （5）梭形细胞癌。梭形细胞癌常见于皮肤，但在很多其它上皮组织器官亦可见到。梭形细胞癌组织像与梭形细胞黑色素瘤或非典型纤维黄色瘤等有时是难以区分的，是皮肤活检鉴别诊断中常常碰到的问题。使用广反应性角蛋白单隆抗体能够解决这一问题，特别联合使用其它抗体，如S100等，更为可靠。当然，由于上皮细胞向间叶样细胞表型的转移可能伴随角蛋白表达的下降或消失、致使某些梭形细胞癌仅可局灶性表达角蛋白，甚至有时用免疫细胞化学方法不能检测出来。因此，遇到难以诊断的皮下梭形细胞肿瘤时，当角蛋白阴性、S100与波形蛋白阳性时，宜诊断为黑色素瘤；而只有角蛋白阳性时，才可诊断为梭形细胞癌；当角蛋白和S100均阴性、而波形蛋白阳性时，诊断为非典型纤维黄色瘤。 （6）滑膜肉瘤和上皮样肉瘤。一般认为，这两种肿瘤乃起源于间叶组织的肿瘤，但能表达角蛋白。这一特征在与具有相似形态的其它肿瘤鉴别诊断中很有帮助。单相性滑膜肉瘤常需与纤维肉瘤、恶性神经鞘瘤及其它一些梭形细胞肿瘤鉴别，而单相性滑膜肉瘤时常有广反应性角蛋白的局灶性阳性表达，其它肿瘤则为阴性表达。上皮样肉瘤有时可误诊为透明细胞肉瘤、横纹肌肉瘤、甚至炎性肉芽肿。上皮样肉瘤表达角蛋白的特征，具有鉴别诊断价值，由于后三者并不表达角蛋白。 （7）脊索瘤。在某些情况下，难以区分脊索瘤与高度恶性的软骨肉瘤。由于前者表达角蛋白而后者不表达，这一问题即可得以解决。 （8）神经内分泌癌。神经内分泌癌包括雀麦细胞癌，可表达低分子角蛋白，但在雀麦细胞癌的表达可为局灶性的。因此，如果没有足够标本，则难以得到证实。皮肤的Merkel细胞癌有时与淋巴瘤难以区分，但Merkel细胞癌强表达角蛋白，并且其表达方式常常具有一定的特征性，即角蛋白分布呈包涵体样阳性，这种特性阳性表达形式在其它神经内分泌肿瘤亦常可见到，但在未分化小细胞癌则难见到。 （9）间皮瘤。文献报道，所有的间皮瘤包括上皮样型，混合型和肉瘤型都可广反应性角蛋白单克隆抗体有强反应。由于间皮瘤与多数腺癌对角蛋白的表达强度与在胞浆中的分布相似，因此，上述抗体对区分两者没有帮助。但是，使用不同表型角蛋白的抗体，可能对区分两者有一定价值。当然，通过使用针对其它非中间丝抗体在上述鉴别诊断中也会有所帮助。 3．有限特异性的角蛋白单克隆抗体本组抗体能通过对富含细胞骨架标本的凝胶电泳免疫反应，识别非共有的角蛋白表位，但并不一定说明这些单克隆抗体能通过组织学方法成功测定角蛋白的免疫表型。因而还不能肯定这些单克隆抗体对上皮组织肿瘤的进一步分类具有价值，这里不作一一介绍。但是，对已明确知道其免疫反应类型的某些抗体，则可予以使用。比如，对不能识别角蛋白18的单克隆抗体，如AE[XB]1[/XB]特别适合在富含角蛋白18的组织（如肝脏）中弄清是否存在肿瘤性上皮细胞，因为只有肿瘤细胞才能被染色。又如CAM—5.2能够识别绝大多数腺癌。但不能染正常表皮，因此对佩吉特氏病（Paget’s）具有诊断价值。 [b]（二）有关方法学应注意的问题[/b] 1．抗体的选择实践证明，角蛋白单克隆抗体较异源性抗血清有更多优点。但应该注意，有些单克隆抗体对大分子角蛋白具有特异性，然而组织固定能破坏其表位。大多数针对小分子角蛋白的单克隆抗体比异源性抗血清显示了高敏感性和特异性。 关于对照问题，参见有关章　节　，这里只作扼要介绍。如同每个免疫细胞化学试验一样，角蛋白的免疫细胞化学研究也必须设计适宜的组织对照和抗体对照。组织对照包含以下三方面内容：一是应当应用明确不表达角蛋白的组织作为理想的阴性对照，如纤维母细胞、血管和淋巴细胞。这一目的在同一组织切片上即可达到，并且不会受到因重取标本时固定或处理过程不同等因素的影响；二是在某些标本中，残存的正常上皮组织可能作为阳性对照。此外，可以设计含有多种肿瘤或正常组织的石蜡包埋的组织块，亦可达到一举多得的目的。抗体对照时，一般应当采用与第一抗体同免疫球蛋白、同浓度的无关单克隆抗体作替代试验。 2．交叉反应问题由于中间丝有很多分子同源现象的共有区域，因此有些抗血清甚至单克隆抗体表现了对其它中间丝的反应性，但仍以异源性抗血清多见。在与角蛋白有关的交叉反应中，已经注意到有些上皮性肿瘤可以同时表达角蛋白和波形蛋白。但未分化癌的这种表达却十分罕见，即使见到，广反应性角蛋白的阳性反应远比波形蛋白强得多。此外，尚有个别角蛋白单克隆抗体，如KA[XB]4[/XB],偶可与神经胶质原纤维酸性蛋白（glialfibrillary acidic protein, GFAP）有交叉反应。由于肿瘤恶性转化中某些无关抗原的异常合成，也要予以考虑。总之，避免交叉反应所致的错误，诊断或鉴别时最好使用一组有关抗体，而不是仅用一个抗体。 3．显示角蛋白固定剂的选择与蛋白酶消化福尔马林固定有时可以破坏或遮蔽角蛋白的抗原决定簇。实践证明，酒精固定对保存角蛋白的抗原性优于甲醛固定，且不必消化。用蛋白酶消化以暴露其抗原决定簇，能提高免疫细胞化学的敏感性，但对某些肿瘤却有增加与其它中间丝的交叉反应的可能性。与消化有关的其它具体方法问题请见有关章　节　。