五、研究神经递质的超威结构定位
应用免疫电子显微镜技术（常用为PAP法或胶体金标记技术）可显示抗原在神经细胞内的超威结构定位及在突触水平神经元间的联系的化学本质。Pickel应用免疫电镜观察证明TH存在于DA和DA能神经元的细胞体、树突和近侧轴突。在胞体内此酶定位于内质网、Golgi器和微管上。神经终末枝的突触小泡一般认为是神经递质的亚细胞贮存部位，在电镜下观察神经末梢内突触小泡呈现不同形态，目前已有文献报道的近10余种，比较常见的为无颗粒小泡型（Small agranular vesicles , SAV）或称清亮小泡型（SmallClear Vesicles, SCV），其直径50～90nm，中心无颗粒（图11-1E）；该型常混有不同比例含致密核心的大囊泡，直径80～150nm。其次是颗粒小囊泡型（Small granular vesicles, SGV），直径45～70nm，内含有电子密度高的致密核心（图11-1A）。第三是大颗粒泡型（large granular vesicles, LGV），直径80～160nm的突触小泡内含有电子密度高的致密核心（图11-1B）。其它还有扁平囊泡型、线粒体型等（图11-1）。是否不同形态的突触小泡代表了含有不同种类的神经递质尚有争论。有学者认为不同形态的突触小泡只是使用不同种类固定液的人工假象，然而越来越多的实验证明表明，固定液的种类固然有一定影响，但神经终末突触小泡的形态和内含递质的种类似乎存在一定的相关性，SAV型是取得比较一致意见的神经终末类型，它和骨骼肌运动终板（也是神经—肌肉的突触）内所含突触小泡的形态相一致，后者已证明为乙酰胆碱神经递质的贮存处，细胞化学示Ach阳性反应，电刺激时突触小泡减少，示释放现象。这种类型的突触小泡内可能含有乙酰胆碱。
[img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/shiyongmianyixibaoyuhesuan/shiyongmianyixibaoyuhesuan082.jpg[alt]神经末梢突触中囊泡类型 [/alt][/img]
图11-1 神经末梢突触中囊泡类型
SGV型一般认为是单胺介质的贮存部位，单胺类介质。包括儿茶酚胺和吲胺二种，属于前者的介质有去甲肾上腺素、多巴胺、肾上腺素、属于后者的介质为5—HT。在常规电镜生物样品处理的过程中，小颗粒囊泡不易显示，须应用0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）配制的3%高锰酸钾溶液（Richardson1966）或铬酸盐/重铬酸盐溶液（Tranzer 1976）固定，方能获得满意结果。认为SGV是单胺递质贮存部位的根据是：用利血平注射能使小泡内致密核心消失，而用伪介质（Pseudo—neurotransmitter ）如5-羟多巴胺（5—OHDA ）注射动物，由于伪介质能置换内源性单胺而被吸收和贮存于突触囊泡中，末梢中小颗粒囊泡的数目增加，电刺激交感神经可使小颗粒囊泡减少，而将α甲基去甲肾上腺素给予被拟交感神经药物或被电刺激耗竭了介质的动物，其神经末梢中的小颗粒囊泡又可重新出现。但1982年Wilson等应用多种实验证明，至少在小肠肌间神经丛内，肾上腺素能神经的终末支是扁平无颗粒囊泡型（flat agranular vesicles, FAV），而不是SGV型。1965年Taxi在两栖类动物的肠道中发现含大颗粒囊泡的神经终末支LGV，Baumgarten(1970)在哺乳动物肠道也发现了LGV型神经终末支，因其形态与丘脑下部含肽的神经末支相似，故命名为P型神经终末支，意即肽能神经（Peptidergic nerves）终末支，而有作者认为凡是颗粒囊泡，包括SGV和LGV都是单胺类递质的贮存部位。免疫电镜技术部分地解决了这一争论。应用PAP和胶体金免疫电镜技术证明VIP、SP、降钙基团相关肽（CGRP）和神经肽Y（NPY）等多肽类物质确实定位于大颗粒囊泡中（Larsson 1976, Bishop 1982, Probertet al, 1983）。有作者还认为不同种类的多肽分别被包含于不同直径的大颗粒囊泡中，如SP定位于直径85nm的大颗粒囊泡中；VIP：囊泡直径98nm；ENK：囊泡直径110nm等，但不同作者在不同动物种属和不同组织、应用方法不同报告结果各异，难以结论。Fried（1985）应用免疫组化、电镜技术和密度梯度离心法相结合，证明在大鼠输精管神经终末支小颗粒囊泡中含有NA，而大颗粒囊泡分为三种类型：单纯含NPY或NA，或NA与NPY共存于一个囊泡中。Burnstock还提出直径100～200nm的大的不透明囊泡（LOV型）系嘌呤能神经递质的贮存部位（图11-1，G），神经终末支内全为线粒体所充满的可能属感觉神经终末支（图11-1，H）。凡此种种，都说明虽然免疫电镜提供了神经递质超微结构水平定位定性的可能，但神经终末内突触小泡的形态与神经递质种类之间的关系始终还有待于进一步的研究。如SAV型在外周可能是代表胆碱能神经的终末支，在中枢能否说SAV内所含的都是乙酰胆碱，其它各型的突触小泡内所含神经递质的种类也还需要进一步研究。在技术方法上的运用，根据笔者体会，应用免疫电镜PAP法，免疫反应复合物相当大，有时很难准确地判断免疫反应复合物的定位，因在囊泡基质内和囊泡膜上雹有反应物附着，免疫胶体金电镜技术避免了上述缺点，胶体金颗粒的沉积比较集中于囊泡基质内，在递质超微结构定位的研究上似较PAP法优越。
