(一)纯化标记化合物的常用方法

不论使用何种制备方法,要获得合格的标记化合物,都必须将反应物经过仔细的分离、纯化。另外,一些标记化合物,经过一定时间的存放后,往往会出现不纯物,而需再纯化。如碘标记生长激素([SB]125[/SB]--HGH),在刚标记的第2天,从Sephadex G-100过滤谱上可见,几乎所有的碘化HGH都集中在峰II;保存1个月后,峰II组份减少,峰I和峰III成分明显增加,峰I是集聚的标记生长激素,而峰III是不具有免疫活性的放射性化学杂质(图8--3)。 [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/shiyongmianyixibaoyuhesuan/shiyongmianyixibaoyuhesuan045.jpg[alt]125I—HGH的SephadexG-100过滤谱[/alt][/img] 图8-3[SB]125[/SB]I—HGH的SephadexG-100过滤谱 实线:新鲜制备的[SB]125[/SB]I—HGH 虚线:保存1个月的[SB]125[/SB]I—HGH 标记化合物的纯化方法,除制备比活度低而化学量又较多的标记物可用重结晶、蒸馏、萃取等常规方法外,一般需用微量分离技术,较方便的是层析法、离子交换法、凝胶过滤及高效液相层析法等。现以碘标记蛋白为例,说明以上各种方法的适用情况。 1.凝胶过滤法常用的是SephadexG系列,也有Biogel—P系列。分离标记蛋白与无机碘时,通常用Sephadex G—25或G—50,然后用G—100进一步纯化。 2.离子交换法一般是制成离子交换层析柱,用于分离纯化短肽标记物。 3.透析法 能将标记蛋白与小分子化合物很好地分离。 4.电泳法可用来分离单碘化、多碘化及已受损伤的蛋白质。 5.亲和层析法利用蛋白质与其特异抗体或受体的结合来分离、纯化标记蛋白质。此法特异性强,保持生物活性好,但操作较复杂。 6.高效液相层析法此法最大优点是分离效果好、快速,但需特殊设备。 7.伴刀豆球蛋白A(ConA)吸附法ConA是一种植物凝集素,对糖蛋白有良好吸附能力,因此适于分离标记糖蛋白。吸附的标记糖蛋白可用含0.2mol/L甲基α-吡喃葡萄糖苷的PBS洗脱。