2．断裂—标记免疫电镜技术

此法是先进行冷冻断裂，再做免疫标记，从而可以对断裂开的各种膜结构及胞浆断面进行标记。 （1）临界点干燥法 ①固定：1.0%～2.5%戊二醛PBS液4[SB]℃[/SB]1～2h，PBS冲洗3min×3。 如为细胞悬液，可加入30%BSA后加入1%戊二醛，使BSA凝胶化，将凝胶切成2mm左右的小块，用30%的甘油—PBS浸透后置于用液氮冷却的Freon中冷却。 ②冷冻断裂，将冰冻的凝胶小块放在盛有液氮的培养皿中，培养皿放置于二氧化碳—液氮槽中，用预冷的解剖刀切割凝胶小块进行冷冻断裂。 ③解冻，置碎块于30%甘油—1%戊二醛磷酸缓冲液中解冻。 ④置换甘油，放入1mmol/l 氨基乙酰甘氨酸磷酸液去甘油，PBS冲洗，3min×2。 ⑤免疫标记。 ⑥1%锇酸，室温固定30min。 ⑦系列梯度乙醇脱水，临界点干燥，喷镀铂—碳膜，次氯酸钠清洗复型，蒸馏水洗，捞于有Formvar 膜铜网上透射电镜观察。 （2）超薄切片法 步骤：①至⑤同临界点干燥法。 ⑥1%锇酸，室温固定2h，系列酒精或丙酮脱水，常规电镜包埋。 ⑦切半薄片，光镜定位合适的断裂部位，再切超薄切片，铀铅染色，透射电镜观察。 断裂标记法目前文献报告应用较多的是植物凝集素—胶体金免疫标记技术，常用的如刀豆球蛋白（Con A）-- 胶体金免疫标记技术，如第六章　所述，Con A 能与细胞膜中的甘露糖结合，能标记内质网膜、核被膜以及细胞膜的EF面，有助于糖蛋白在超微结构水平的定位。 为保证实验结果的准确性，每组实验在免疫标记阶段应设立对照组。对照组的设计同第一章　总论中的免疫对照染色。