三、包埋

[b]（一）树脂包埋[/b] 国内现普遍采用的是环氧树脂包埋法，可直接脱水后包埋，也可将小片组织或半薄切片贴在载片上，将充满环氧树脂的明胶囊倒置于切片上聚合、硬化，进行原位包埋。 [b]（二）低温包埋[/b] 常规树脂包埋由于需高温聚合等处理程序，组织抗原性可能全部或部分丢失。因此，在免疫电镜技术方面，国外不少实验室已开始采用低温技术如低温包埋和冰冻超薄切片等，后者需配备冰冻超薄切片机，且技术难度较大，不如低温包埋法易推广。低温包埋剂的研究开始于60年代，80年代免疫细胞化学技术在电镜水平上的广泛的应用，为低温包埋剂的实验研究开辟了广阔的领域。国内已有较多的应用报道，国内一些实验室已开始摸索。作为低温包埋剂的多为乙烯系化合物如乙二醇甲基丙烯酸酯（Glycolmethacrylate,GMA）,Lowicryls, LR White和Lr Gold等，目前国外生产厂家有Polysciences INC , Reichert—Jung 和LKB等系列产品。现将常用的几种低温包埋剂及其应用简单介绍如下： 1．Lowicryls 是丙烯酸盐（acrylate） 和甲基丙烯酸盐（methacrylate）化学物质，包括K4M、HM20、K11M、KM23等系列产品（Polysciences INC），其特点是能在低温下保持低粘度（K4M：--35℃；HM20：-70℃；K11M、HM23：-60℃～-80℃）和具有在光照射（紫外光，波长360nm）下聚合的能力，它的光聚合作用与温度无度。其中K4M和K11M具有亲水性，特别适合于免疫细胞化学的应用，因它能较好地保持组织结构和抗原性，减少背景染色。HM20和HM23具疏水性，能产生高反差图像，适用于扫描、透射电镜和暗视野观察切片的制作。所有这些种类的低温包埋剂都适用于冰冻置换技术。K4M的应用和报道较多，现侧重介绍如下： （1）包埋剂的配制：商品提供的Lowicrys包埋剂由三个部分组成：单体（Monomer），交联剂（Crosslinker）和引发剂（Initator）。调整单体和交联剂的比例，增加交联剂的量，组织块的硬度增加。中等硬度的组织块，其配制比例如下： K4M：单体 17.30g 交联剂2.70g 引发剂0.10g K11M：单体19.00g 交联剂1.00g 引发剂0.10g 作者的经验，可用微量注射器加针头抽取后，注入棕色的玻璃容器避光，用玻棒轻搅3～5min或用一小管通入液氮气泡以搅拌之。勿过分搅拌，以防氧的气泡进入包埋剂中。 （2）生物样品处理程序（Lemanski 等1985） ①动物麻醉取材，以多聚甲醛—赖氨酸—过碘酸钠在9℃固定2h。 ②磷酸缓冲液含7%蔗糖，pH7.2,冲洗过夜，0℃ ③0.1mol/L 磷酸缓冲液，pH7.2,冲洗，0℃ ④脱水：65%乙醇，1h ,0℃ 80%乙醇，2h,-35℃ LowicrylK4M：80%乙醇=1：11h -35℃ LowicrylK4M：80%乙醇=2：11h -35℃ 100%Lowicryl K4M 1h -35℃ 100%Lowicryl K4M 过夜-35℃ ⑤包埋：新鲜K4M置于胶囊内，将组织移入，在-30℃～-40℃以紫外线灯波长360nm 2× 15W（Ladd Research Industries Burlington VT）相距30～40cm照射24h使之聚合。如为100W灯泡，照射距离应大于85cm。聚合后的胶囊移至室温在紫外线下继续照射2～3天，可增加其硬度，便于切片。 （3）免疫染色 ①切片（厚50～70nm）贴在金网或覆有碳膜的镍网上。所有下列步骤在室温、湿盒内进行。所有溶液需经微孔滤纸（0.25～0.45μm）滤过。 ②正常羊血清30min。 ③第一抗血清（PBS稀释），37℃2h。 ④可用烧杯法（或塑料壶喷洗法），以镊夹镍网在第一烧杯中洗荡30min，然后在第二烧杯中洗荡1h 。 ⑤正常羊血清30min。 ⑥第二抗血清（胶金标记抗体）以正常羊血清稀释为1：1，以镍网置于血清滴上孵育1h。 ⑦冲洗如④。 ⑧覆于2%OSO4水溶液上，30min。 ⑨冲洗如④。 ⑩干燥后在电镜下观察。 （4）Lowicryl K4M快速包埋染色法（Altman等1984） ①包埋剂的配制：单 体13g 交联剂2g 引发剂75mg ②生物样品处理：除了聚合这一步骤外，下列所有步骤都在20℃进行。 1）组织用3%戊二醛—3%多聚甲醛磷酸缓冲液，pH7.4,在20℃固定1～2h。用磷酸缓冲液清洗后进行脱水。 2）脱水：在50%、75%和90%的双甲基甲酰胺（Dimethylformamde,DMF）内系列脱水，每步10min。 3）浸透：Lowicryl K4M:DMF=1:2　 10min LowicrylK4M:DMF=1:1 　15min 100%Lowicryl K4M 　20min 100%Lowicryl K4M　 25min 4)包埋与聚合：组织移入装满K4M的胶囊中，以紫外线灯照射聚合（紫外线灯条件同上），灯和组织距离10cm,4℃照射45min，组织块在室温进行超薄切片（切片时水槽内水面应略低以防浸湿组织块的切面）。 5）以覆有碳膜的镍网捞取切片。 6）免疫染色。 整个包埋时间仅需4～5h。 Lowicryls应保存在暗处，-4℃，该物质有刺激性，在配制时应戴手套，以免触及皮肤。在通风橱内操作，以免蒸气刺激眼睛。如触及皮肤和眼睛，应立即以水冲洗局部，氧化重金属如KmnO4能与包埋剂作用而影响染色效果，以不用为佳。 2．LR White 和Lr gold 是一种混合的丙烯酸单体的透明树脂，具有极低的粘度（8cps）和较强的嗜水性，因此有较强的穿透性，有利于抗体（或抗原）和免疫化学物质穿过LR树脂，达到组织结合部位。在免疫细胞化学的光镜（半薄切片）和电镜水平应用都具有良好效果。标本脱水至70%乙醇即可，能较好地保持抗原性。Lr white和Lr gold在国外提供厂家有 Poly－sciences INC等，Lr gold是一种光引发低发低温聚合的包埋剂，对于免疫细胞化学特别适用，能最大限度地保持组织的抗原与抗体活性，其最佳光聚合温度在-25℃，在聚合后呈现金黄色，因而得名。Lr white可在热和冷两种情况下聚合，热聚合在60℃，24h，冷聚合在-25℃，需加加速剂（accelerator）调整配制比例。生物样品处理与免疫染色等同常规树脂切片。 3．GMA 　是乙二醇甲基丙烯酸酯（Glycol Methacrylate 即2—hydroxyethyl methacrylate, HEMA）的缩写。远在60年代，电镜工作者就试图将其作为生物包埋剂应用于光镜和电镜。GMA作为电镜包埋剂的优点是电子密度大，影像反差好。但存在三个主要缺点：一是包埋聚合后的组织块很脆，不易修整和切片。二是聚合过程中易造成组织损伤如人为的细胞器肿胀。三是缺乏稳定性，不能承受电子束的轰击，包埋剂遇热升华，造成组织塌陷变形。故后来为环氧树脂所取代。聚合后的环氧树脂有良好的塑料稳定性，能承受电子束的轰击不变形，而且影像反差好，分辨率高，但其半薄切片染色不够满意始终是个有待解决的问题。而GMA包埋切片的染色效果明显优于环氧树脂。于是电镜工作者如Leduc和Bernhard（1986）尝试以增加一定比例的增塑剂如甲基丙烯酸酯和少量水外，并加入适量的增塑剂如聚乙二醇400（PEG400）以改变其硬度，加入适量的闻联剂乙烯二甲基丙烯酸酯（ethylene dimethacrylate）以增强其抗电子束轰击的稳定性。为避免聚合时过快，产生高温，损伤组织结构，选用低温型引发剂—过氧化苯甲酰（Benzoyl Peroxide），温度范围-10℃～-30℃。经过不断的配制改进，现GMA已广泛应用于半薄切片（1～3μm）的光镜观察，特别是组织化学方面的研究和电镜水平的免疫细胞化学技术。现将GMA包埋剂的配制、生物样品处理和电镜水平的免疫细胞化学染色方法简介如下： （1）GMA单体溶液在出厂时都加有氢醌类稳定剂，用前须以每25ml单体溶液加一匙活性碳，在振荡器上振荡5min，过滤以除去氢酯，以免影响聚合。 （2）包埋剂的配制： a. 100%GMA66.5ml N—甲基丙烯酸丁酯　28.5ml 5%乙烯二甲丙烯酸酯　5.0ml 1.5 %过氧体苯甲酰　1.0g 1.0%PEG4001.0ml b.A液： GMA单体液 90ml PEG 400　5～9.4ml 过氧化苯甲酰0.2～0.69g 搅拌溶解后置棕色瓶内；　4℃保存。 B液： PEG 400　 20ml 二甲基苯胺1ml 应用时A：B按10：1比例充分混合（张承志等1986）。 （3）生物样品处理：组织固定可用PLP液或1%戊二醛溶液（磷酸缓冲液配制，pH7.4）。经系列酒精脱水至新鲜的GMA单体溶液中浸24h。以上步骤可在室温或4℃进行。 （4）包埋聚合：组织移入盛潢包埋液的胶囊内，先放在真空泵内以去除包埋液中的气泡，然后在4℃，以紫外线灯（波长360nm）在距胶囊底部10～20cm处进行照射12～16h，以手指捏胶囊试其硬度可知聚合是否完成。在聚合完成后，将胶囊丢入热水中以去除胶囊外壳。 （5）切片贴在镍网上，按PAg技术进行包埋染色，其区别于EPON包埋剂者，在于GMA包埋切片染色所需时间较短，在第一抗血清中，GMA室温只需孵育1h，而EPON包埋切片需16～20h；在第二抗血清，即Pag 复合物中室温30min，而EPON包埋切片需1h。铀、铅双染后，电镜观察。 低温包埋剂常用于铁蛋白或胶体金免疫电镜技术的包埋后染色。能检出应用环氧树脂包埋难以检出的多种抗原。