三、凝集素在免疫细胞化学中的应用
凝集素可为荧光素、酶和生物素等所标记，分别进行下列染色法：
[b]1．直接法[/b] 标记物直接标记在凝集素上，使之直接与切片中的相应糖蛋白或糖脂相结合。
（1）切片脱蜡至水。
（2）凝集素标记物（100μg/ml），室温，30min。
（3）TBS洗3次，每次2min。
（4）如为荧光素标记物，封片用荧光显微镜观察。如为酶标记物，则应依次进行呈色、脱水、透明和封固后在光学显微下观察。
直接法的优点是简便，目前商品用的凝集素药盒已能购得。但灵敏性不够高。
[b]2．间接法[/b] 将凝集素直接与切片中的相应糖基结合，而将标记物结合在抗凝集素抗体上。
（1）脱蜡至水。
（2）用含3%的H2O2的甲醇阻断内源性过氧化物酶10min。
（3）凝集素稀释液（100μg/ml）孵育30min。
（4）TBS洗3次，每次2min。
（5）用标记了的抗凝集素抗体（1：100）孵育30min。
（6）TBS洗3次，每次2min。
（7）呈色、脱水、透明、封片。
（8）观察。
间接法染色还可进一步改良为：①三步法：即在凝集素孵育后，接着用抗凝集素抗体孵育，再用标记了的抗-抗凝集素抗体孵育，层层放大，进一步提高其敏感性，PAP复合物也可作为标记物标记在抗-抗凝集素抗体上。②抗生物素—生物素凝集素法：用结合了生物素的凝集素孵育切片后，TBS洗后再以抗生物素—标记物与之结合。间接法较直接法和直接法敏感性高5～10倍或更多一些，但必须购买或自制抗凝集素抗体。
[b]3．糖—凝集素—糖法[/b] 本法是利用过量的凝集素与组织切片中特定的糖基相结合。经冲洗后，凝集素上还存在未被占用的结合部位，将这些部位与有过氧化物酶标记的特异性糖基相结合，形成一个三明治样的糖—凝集素—糖的结合物。
（1）脱蜡至水。
（2）用含3%的H2O2的甲醇阻断内源性过氧化物酶10min。
（3）用100μg/ml的凝集素孵育30min。
（4）TBS洗3次，每次3min。
（5）用100μg/mlHRP标记的糖液孵育30min。
（6）TBS洗3次，每次3min。
（7）DAB呈色、脱水、透明、封固。
本法特异性强，灵敏度高，因为这不象生物素—抗生物素法那样要改变凝集素，又不需要像抗体那样要制备抗体。HRP本身含有甘露糖，能与刀豆凝集素A、扁豆凝集素和豌豆凝集素结合。但对其它的凝集素，本法目前普及还有一定困难，因为要将过氧化物酶结合到其它凝集素上，就需要将一个适当的碳水化合物基团嵌入过氧化物酶，称为糖基化（glycosylation），方法虽不复杂（Lee 等1976），但需一定的试剂和设备。商品化能提供的糖基化过氧化物酶品种尚有限。
【注意事项】
①凝集素需要重金属离子维持其活跃的结合部位，如果金属离子耗尽了，就会影响凝集素的结合能力。因此，有作者主张用TBS作为缓冲液，内加微量的金属，配方是：Tris 60.57g,NaCl87g,H2O加至1000ml，其中含CaCl2、MgCl2各1.0mmol/L。或在进入凝集素孵育前，先用该液孵育，以增强凝集素结合力。
②和其它抗体血清应用一样， 应用每批新的凝集素实验时，都先要用缓冲液稀释成不同等级；如8，16，32，64，125，250，500，1000μg/ml，经染色选择最佳稀释度。
③有作者认为阻断组织内源性过氧化物酶所用的H2O2对碳水化合物有影响，可能改变凝集素的结合形式，因此，应尽量少用或不用，我们及一些作者在实验过程中发现影响不明显。
④有作者认为凡经固定的组织切片，不论是石蜡包埋切片或冰冻切片，都有可能使组织中抗原隐蔽，为了暴露隐蔽了的碳水化合物基团，主张在凝集素孵育前用酶处理切片，常用胰蛋白酶液（配制见附表）进行适当的孵育。
⑤已知哺乳动物的质膜含有占蛋白总量的1%～10%的碳水化合物，它们以低聚糖（oligosacchride）糖脂，并主要以糖蛋白的形式存在，糖蛋白线性的或分支的旁链可能含有两个到多个单糖残基，通常有两种或更多的单糖，在单糖单位末端常常是一个带负电荷的N-乙酰神经氨酸的残基，一个唾液酸（siallic acid）。有作者在凝集素实验中常用神经氨酸酶(neuramidinase)分解细胞表面的唾液酸或神经氨酸，以暴露出隐蔽的能与聚集素结合的次终末的碳水化合物。配制方法是将神经氨酸酶（Type V,Sigma Lot 63F—8172 63F--8172）用醋酸缓冲液（含2%牛血清白蛋白）BSA配成0.5μg/ml。
切片脱蜡后进行酶消化的过程中，将该组织切片置于上述配制液中，在湿盒内，37℃孵育30min。用缓冲液洗后，进行凝集素染色。
⑥对照试验，和其它组化染色一样，凝集素染色也需要设对照试验（最好在相邻切片进行）。由于凝集素具有单糖特异性，如果外加相应的糖，把凝集素的结合部位占有了，凝集素就不能再与组织中的糖基相结合了。一般采用的方法是将凝集素预先与相应的糖（0.2mol/L）在室温孵育30min，使之占有凝集素结合部位，再将此液代替凝集素进行孵育，结果应为阴性。在某些情况下即使提高糖液的浓度也不能达到完全的抑制。这时，只有用与凝集素有高亲合力的低聚糖（oligosachrides）代替或将切片预先用相应的糖苷酶孵育去除特异性糖基（Watanalte等，1981）。
