一、ICC在铺片中应用

铺片（Whole Mount Stretch Preparation） 是研究神经分布应用较早、较广的方法。19世纪末，Dogiel和Cajal等利用铺片技术，结合镀银及甲基蓝染色，观察肠道神经丛模式、神经元种类及其相关联的间质细胞。近年来，人们进一步认识到全层铺片技术的优点：例如①不必采用连续切片和三维重建技术，可以直接观察神经元间质细胞的三维结构；②能观察较大区域，在研究显微外科手术后神经分布模式和数量改变中有较好的应用价值；③操作简单，能在较短时间内制作大量标本等。所以，铺片技术在ICC染色中得到广泛的采用（Zhou等1992） 铺片ICC染色方法与切片基本相同，所不同的是铺片较厚，背景着色较强，有时甚至妨碍特异性染色的观察。实验证明，这种非特异性染色主要是酶标抗体/桥抗体与组织γ-球蛋白结合引起的，用封闭性阻断剂及正常血清等分别孵育切片，并在稀释抗体时，加入适量的BSA，可以降低此类非特异性结合。BSA、封闭性阻断剂与IgG（正常血清）的等电点不同，重叠应用，阻断效果尤佳。另外，铺片的细胞膜完整，不利于抗体的穿透，特别是PAP复合物等大分子物质，为此设法提高抗体的穿透性是非常重要的。采用反复冻融和表面活性剂前处理，有助于细胞内抗原的暴露。我们在实验中参考Costa(1980)的制片方法，将组织铺片经系列酒精（70%、90%、100%、100%，每次10～15min）脱水，Hemo—d 2次（10～15in/次），再水化（100%、90%、70%、50%降酒精）等处理，辅助Triton X-100应用，明显增加抗体的穿透性，获得较为满意的染色效果。　但是，并非所有的组织都能制成铺片，虹膜、肠系膜和小血管等适于制做全层铺片；食道、胃肠道、胆道、胆囊、大血管、输尿管等脏器则均需进行组织分层，再铺片，行ICC染色。 染色方法：以小肠分层铺片为例： （1）4%多聚甲醛或Zamboni 液固定2～6h，4℃，或丙酮固定。 （2）PBS充分冲洗，置PBS中过夜。 （3）系列酒精脱水，Hemo—D透明，降酒精至PBS。 （4）分层铺片，直接漂浮染色或贴于载玻片风干，再染色。 （5）0.3%～0.5%Triton X-100/PBS 15～30min, 室温，PBS冲洗。 （6）封闭性阻断剂30in，室温，正常兔（羊）血清30min，室温。 （7）第一抗体，孵育，4℃冰箱过夜；PBS2次/2min；重复第一抗体孵育（可稀释1 倍），2～3h，室温，充分使抗体穿透至深层，使组织深层的抗原得以与抗体充分结合。 （8）PBS充分冲洗，2～3h，4℃。 （9）酶标抗体孵育，4℃冰箱过夜。 （10）PBS冲洗，呈色，观察与切片相同。