五、增加染色强度方法

通常染色、着色较弱时,应想办法改进标本的处理的抗原的保存,提高抗体的穿透力,再重新染色。但有时组织本身抗原含量较少或标本难得(如手术材料),可尝试下述方法以提高染色强度,确保染色成功。 [b]1.重复显色[/b]一般认为,对ALP标记抗体,延长显色时间其反应可增强。但在同一染色液中延长显色时间,往往容易产生沉淀,出现终产物弥散现象。所以重新配制显色液继续呈色,第二孵育时间可缩短至4~5min,能提高部分染色强度。 HRP标记时,重复呈色无明显增强效应。通常在显色液中加入0.01mol/l Imidazole 或改用酸性缓冲液(pH5.5~6.0),可提高染色强度;亦可在DAB反应后,1%OSO4浸泡固定5~15min,继之0.4%亚铁氰化钾/0.1N HCl液处理5min,DAB终产物呈黑色,与背景的对比度较佳。另外,在间接法显色较弱时,亦可试用PAP法、ABC法等,探索较合适的染色方法。 [b]2.重复第一抗体[/b]在漂洗过程中,结合力弱的抗体易离解丢失,重复应用第一抗体有利于抗体与组织抗原结合,增加抗体数量,提高染色强度(Noorden 1983)。切片经第一抗体孵育后,漂洗,再孵育第一抗体(此时第一抗体可稀释较原工作浓度1至数倍)2~4h,然后经酶标抗体孵育,呈色观察同前。所用抗体为多克隆血清时,提高第一抗体的稀释度,重复孵育2~3次,可得到一定效果。单克隆抗体,经第一抗体—酶标抗体—第一抗体—酶标抗体,也能增加染色强度。 [b]3.双桥PAP法[/b](Vacca 1982) 基本操作与单桥法相似,所不同的是切片经单桥PAP复合物孵育后,漂洗,再孵育桥抗体和PAP复合物(均可稀释1倍),即切片经两次桥抗体、两次PAP孵育—双桥法(Double bridged technique)。据报告,第一抗体用较高稀释度(例单桥法两倍),也能获得与双桥法相近的染色效果。 理论上讲,双桥法是ICC染色中较为敏感的方法,它较单桥法灵敏20~50倍,能够增加抗原的显示数量(25%)和反应终产物的大小。这在研究胚胎发育过程中一些抗原含量较低的组织时,具有一定的应用价值。双桥法可能是通过下列途径提高其敏感性的:①重复的桥抗体与PAP复合物中的抗HRP抗体的未饱和抗原位置结合,再连结另外的PAP复合物,在抗原部位抗体间彼此结合形成较大的抗原抗体复合物,具有多个酶分子(图4-9A),使反应增强。这可能是双桥法敏感性增高的主要机制;②重复的桥抗体与第一抗体未饱和的抗原位置结合,使第一抗体上结合较多的桥抗体及PAP复合物(图4-9B)。但PAP复合物较大,应设法提高其穿透性,达到增加染色强度的目的。 [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/shiyongmianyixibaoyuhesuan/shiyongmianyixibaoyuhesuan031.jpg[alt]双桥PAP法的两种放大原理 [/alt][/img] 图4-9 双桥PAP法的两种放大原理 [b]4.半抗原夹层法[/b](Hapten Sandwich Method)  首先用半抗原(FITC等)标记的第一抗体与组织抗原结合,继之用HRP(或ALP)标记的抗FITC抗体与组织抗原结合的FITC的反应,呈色后观察抗原存在部位。FITC为一种荧光色素,荧光显微镜下呈亮绿色荧光,所以也可以同时观察免疫荧光染色结果。FITC特异荧光褪色后,其抗原性仍不丢失,从这种角度讲,荧光抗体法的切片亦能半永久保存。该法较一般间接法敏感性高,最大优点是不管第一抗体来自何种属,只要与FITC连结,均可被同一酶标记的抗FITC抗体识别。避免了准备不同种属的酶标抗体的麻烦,而且FITC标记抗体技术成熟、稳定,商品种类多,容易购买,实验者不妨一试。