二、假阳性及其处理

组织成分与各种染色试剂及抗血清之间的非特异性结合称假阳性，其主要原因和处理方法如下： 1．组织细胞内色素　 与DAB沉淀物颜色类似的色素，例如黑质内的神经黑色素，不易与反应产物区别开来。可用其它电子供体或免疫荧光技术鉴别之，亦可改用ALP代替HRP，进行染色。 2．假过氧化物酶活性RBC内的血红素辅基有类过氧化物酶活性，当组织内存在红细胞时，即使不加过氧化酶，亦可出现阳性染色。用甲醇-0.3%H2O2孵育标本15～20min（室温），能抑制这种假阳性。甲醇可以使血红素蛋白中的（亚铁）血红素游离，后者被H2O2破坏，从而抑制类过氧化物酶的活性。一般认为，RBC的染色容易同其它组织细胞区别，且动物实验还可通过灌注冲洗组织内的RBC，所以此步往往被省略。 3．内源性过氧化物酶活性粒细胞、巨噬细胞等存在内源性过氧化物酶，能够与DAB-H2O2反应，导致假阳性，所以含此类细胞较丰富的脾脏、肝脏、骨髓等组织，ICC染色时，最好做内源性酶阻断。适当的固定、经酸酒精孵育15～20min，或1%乙酸-甲醇硝基铁氰化物处理，冰冻切片可用苯肼孵育15～20min，均能不同程度地抑制内源性酶的活性。近年Li(1987)报告，应用0.1%NaN3 0.3%-- H2O2孵10～15min（室温）能较好地抑制内源性过氧化物酶的活性，冰冻切片效果尤佳。嗜酸性粒细胞内源性过氧化物酶活性较强，上述各种处理后，仍残留部分活性，此种情况，在DAB-H2O2显色液中加入终浓度为0.05NaN3,基本上可达到完全阻断的作用。但是，各种封闭内源性（假）过氧化物酶方法均不同程度地破坏组织的抗原性，所以在不影响反应结果判断或能够同内源性酶的反应所致的假阳性区别时，尽量避免此类处理或改用ALP代替HRP进行ICC染色，也可以在用第一抗体与抗原反应结合后，再进行消除内源酶的处理。 4．游离醛基醛类固定的组织切片上，可能存在些游离醛基，后者能与蛋白质（含IgG）间非特异性结合，导致假阳性，用白蛋白或封闭性阻断等预先孵育切片，可封闭之。 5．疏水键和离子键免疫球蛋白可通过疏水键或离子键与组织中的碱性蛋白或Fc受体（冰冻切片Fc受体保存尤佳）非特异性结合。用正常血清（制备第二抗体种属的血清为首选），于第一抗体前孵育切片，可消除之。“4”和“5”重叠应用，更有利于降低背景染色。 6．天然抗体及不纯抗体 　天然抗体是指因动物自然感染等原因血清中存在的部分抗体：不纯抗体是指在制备血清时，所用的抗原不纯，获得的抗体含有杂质抗体。当天然抗体或不纯抗体与组织成分结合时，可引起非特异性染色。上述二者的含量均较低，增加第一抗体的稀释度，可以降低其非特异性染色。 7．载体蛋白抗体　 制备小分子多肽（分子量小于4kD）的抗体时，需借助载体蛋白，使小分子多肽获得免疫原性，刺激动物产生特异性抗体。因载体本身具有抗原性，故动物同时也产生抗载体蛋白抗体，与组织蛋白结合后，引起背景染色。用固相吸收技术，能将载体蛋白抗体除去。一般市售抗体，均经特异性检测，所以“6”和“7”可不必考虑。