(三)葡聚糖凝胶G-50柱层析法

除游离荧光素可用2×46cm柱层析法,详细方法参阅第二章 。加入荧光抗体15~18ml(按床体积的5%~10%加样),使其缓慢渗入柱内,待即将全部入柱时,加入PBS少许,关闭下口,停留30~40min ,使游离荧光充分进入细筛孔中,然后再接通洗脱瓶开始滴入洗脱液。加入洗脱液一定量后,荧光抗体即向下移行,逐渐与存留于上端的游离荧光素之间拉开明显的界线,随着大量洗脱液的不断加入,二者分离距离越来越大,荧光抗体最先流出,分前、中、后三部分收集,测F/P比值,合格者合并,浓缩,分装。洗脱液用20%磺基水杨酸测定蛋白(发生沉淀反应),继续洗脱,游离荧光素则相继被洗脱下来,至洗脱液中无蛋白和荧光素后,此层析柱即可再用。 若用以除去荧光抗体中的游离荧光素和硫酸铵等盐类,可先在过柱前透析一夜,否则,NH4+太浓,在蛋白未完全洗脱时即出现NH4+,因而影响提纯与回收蛋白,一般待洗脱液出现蛋白时,即进行收集,之后出现SO4++(用1%BaCl2检查发生白色沉淀)。最后是NH4+,(用纳氏试剂检查呈黄棕色沉淀),待洗脱液无SO4++及NH4+后可再用。 如仅用小量荧光抗体,可用1×20cm的柱层析柱,取2g Sephadex G-50装柱,即可过滤2~3.5ml荧光抗体。