（三）补体法

1．材料 （1）免疫血清60℃灭活20min，用Kolmers 盐水作2倍稀释成1：2，1：4，1：8……。补体用1：10稀释的新鲜豚鼠血清，抗补体荧光抗体等，按下述的补体法染色。免疫血清补体结合的效价，如为1：32则免疫血清应作1：8稀释。 （2）补体用新鲜豚鼠血清一般作1：10稀释或按补体结合反应试管法所测定的结果，按2单位的比例，用Kolmers盐水稀释备用。Kolmers盐水配法：即在pH7.4、0.1mol/L的磷酸缓冲盐水中，溶解MgSO4的含量为0.01%浓度。 （3）抗补体荧光抗体：在免疫血清效价为1：4，补体为2单位的条件下，用补体染色法测定免疫豚鼠球蛋白荧光抗体的染色效价，然后按染色效价1：4的浓度用Kolmers盐水稀释备用。 2．方法步骤 （1）涂片或切片固定。 （2）吸取经适当稀释之免疫血清及补体之等量混合液（此时免疫血清及补体又都稀释一倍）滴于切片上，37℃作用30min，置于保持一定湿度的染色盒内。 （3）用缓冲盐水洗2次，搅拌，每次5min，吸干标本周围水液。 （4）滴加经过适当稀释之抗补体荧光抗体30min，37℃，水洗同（3）。 （5）蒸馏水洗1min，缓冲甘油封固。 3．对照染色 （1）抗原对照。 （2）抗血清对照：用正常兔血清代替免疫血清。 （3）灭活补体对照：将补体经56℃30min处理后，按补体同样比例稀释，与免疫血清等量混合后，进行补体法染色。 本法之荧光抗体不受免疫血清的动物种属的限制，因而一种荧光抗体可作更广泛的应用，敏感性亦较间接法高，效价低的免疫血清亦可应用，节　省免疫血清，尤其是对检查形态小的如立克氏体、病毒颗粒等或浓度较低的抗原物质时甚为理想。