（二）细胞融合

1．细胞融合前准备 （1）骨髓瘤细胞系的选择：骨髓瘤细胞应和免疫动物属于同一品系，这样杂交融合率高，也便于接种杂交瘤在同一品系小鼠腹腔内产生大量McAb。常用的骨髓瘤细胞系见表2-4。 表2-4用于融合试验的主要骨髓瘤细胞系

名 称	来 源	耐 受 药 物	Ig链
			H L
P3/X63-Ag8(X63)	BALB/C骨髓瘤MOPC-21	8-氮鸟嘌呤	r1 　K
P3/X63-Ag8.653(X63-Ag8.653)	P3/X63-Ag8	8-氮鸟嘌呤	－ －
P3/NSI-1-Ag4-1(NS-1)	P3/X63-Ag8	8-氮鸟嘌呤	－ K（不分泌型）
P3/X63-Ag8.Ul(P3Ul)	（X63×BALB/C脾细胞）杂交瘤	8-氮鸟嘌呤	－ －
SP2/0-Ag14(SP2/0)	（X63×BALB/C脾细胞）杂交瘤	8-氮鸟嘌呤	－ －
F0	BALB/C骨髓瘤	8-氮鸟嘌呤	－ －
S194/5.XXO.BU.1	P3/X63-Ag8	5-溴脱氧尿嘧啶核苷	－ －
MPC11-45.6TG1.7	BALB/C骨髓瘤MPC-11	6-巯鸟嘌呤	r2b 　K
210.RCY3.Ag1.2.3	LOU大鼠骨髓瘤R210	8-氮鸟嘌呤	－　 K
GM15006TG-A12	人骨髓瘤GM1500	6-巯鸟嘌呤	r1 　K
U-266AR	人骨髓瘤U-266	8-氮鸟嘌呤	ελ

骨髓瘤细胞的培养可用一般的培养液，如RPMI1640，DMEM培养基。小牛血清的浓度一般在10%～20%，细胞浓度以104～5×105/ml为宜，最大浓度不得超过106/ml。当细胞处于对数生长的中期时，可按1：3～1：10的比例传代。每3～5天传代一次。细胞在传代过程中，部分细胞可能有返祖现象，应定期用8-氮鸟嘌呤进行处理，使生存的细胞对HAT呈均一的敏感性。 （2）饲养细胞：在组织培养中，单个或少数分散的细胞不易生长繁殖，若加入其它活细胞，则可促进这些细胞生长繁殖，所加入的这种细胞数被称为饲养细胞。在制备McAb的过程中，许多环节　需要加饲养细胞，如在杂交瘤细胞筛选、克隆化和扩大培养过程中，加入饲养细胞是十分必要的。常用的饲养细胞有：小鼠腹腔巨噬细胞（较为常用）、小鼠脾脏细胞或胸腺细胞。也有人用小鼠成纤维细胞系3T3经放射线照射后作为饲养细胞。饲养细胞的量为一般为2×104或105细胞/孔。 2．细胞融合的步骤 （1）制备饲养细胞层：一般选用小鼠腹腔巨噬细胞。 与免疫小鼠相同品系的小鼠，常用BALB/C小鼠，6～10周龄 ↓ 拉颈 处死，浸泡在75%酒精内，3～5min ↓ 用无菌剪刀剪开皮肤，暴露腹膜 ↓ 用无菌注射器注入5～6ml预冷的培养液（严禁刺破肠管） ↓ 反复冲洗，吸出冲洗液 ↓ 冲洗液放入10ml离心管，1200rpm/分离5～6min ↓ 用20%小牛血清（NCS）或胎牛血清（FCS）的培养液混悬，调整细胞数至1×105/ml ↓ 加入96孔板，100μl/孔 ↓ 放入37。c CO2孵箱培养 （2）制备免疫脾细胞 最后一次加强免疫3天后小鼠拉颈处死 ↓ 无菌取脾脏，培养液洗 一次 ↓ 脾脏研碎，过不锈钢筛网 ↓ 离心，细胞用培养液洗2次 ↓ 计数 ↓ 取108脾淋巴细胞悬液备用 （3）制备骨髓瘤细胞 取对数生长骨髓瘤细胞离心 ↓ 用无血清培养液洗2次 ↓ 计数，取得×107细胞备用 （4）融合 ①将骨髓瘤细胞与脾细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml离心管中用无血清不完全培养液洗1次，离心，1200rpm,8min;弃上清，用吸管吸净残留液体，以免影响聚乙二醇（PEG）浓度。轻轻弹击离心管底，使细胞沉淀略松动。 ②90s内加入37℃预温的1ml 45%PEG（分子量4000）溶液，边加边轻微摇动。37℃水浴作用90s。 ③加37。C预温的不完全培养液以终止PEG作用，每隔2min分别加入1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和6ml。 ④离心，800rpm, 6min。 ⑤充上清，用含20%小牛血清HAT选择培养液重悬。 ⑥将上述细胞，加到已有饲养细胞层的96孔板内，每孔加100μl。一般一个免疫脾脏可接种4块96孔板。 ⑦将培养板置37℃、5%CO2培养箱中培养。