二、细胞和组织的固定

[b]（一）固定[/b] 为了更好的保持细胞和组织原有的形态结构，防止组织自溶，有必要对细胞和组织进行固定。固定的作用不仅是使细胞内蛋白质凝固，终止或抑制外源性和内源性酶活性，更重要的是最大限度的保存细胞和组织的抗原性，使水溶性抗原转变为非水溶性抗原，防止抗原弥散。 不同抗原，其稳定性也不相同，因而对固定剂的耐受性差异较大。如T淋巴细胞表面抗原属不稳定性抗原，对固定剂的耐受较差，抗原活性容易丧失。而HBsAg属稳定性抗原，其抗原活性很少受固定剂种类、固定时间、温度等因素的影响。 [b]（二）固定剂[/b] 用于免疫组织化学的固定剂种类较多，性能各异，在固定半稳定性抗原时，尤其重视固定剂的选择，介绍如下。 1．醛类固定剂双功能交联剂，其作用是使组织之间相互交联，保存抗原于原位，其特点是对组织穿透性强，收缩性小。有人认为它对IgM、IgA、J链、K链和λ链的标记效果良好，背景清晰，是常用的固定剂。 （1）10%钙-福尔马林液（浓甲醛10ml，饱和碳酸钙90ml）。 （2）10%中性缓冲福尔马林液（浓甲醋10ml，0.01mol/l pH7.4 PBS 90ml）。 （3）4%多聚甲醛磷酸缓冲液pH7.4（多聚甲醛40g,0.1mol/L PBS液pH7.4500ml，两者混 合加热至60℃，搅拌并滴加1nNaOH至清晰为止，冷却后加PBS液至总量1000ml）。 （4）戊二醛-甲醛液（戊二醛1ml，浓甲醛10ml，蒸馏水加至100ml）。 戊二醛是二醛基化合物，交联结合力比甲醛大，Bullock认为交联过强，可出现组织改变和空间遮蔽现象，影响组织的抗原性。但McDonald等认为，该试剂用于PAP法免疫酶标记效果仍满意。 （5）甲醛升汞固定液（即B5固定液。浓甲醛10ml，氯化汞6g,醋酸钠1.25g,蒸馏水90ml）。 有人认为此固定液悬液是较理想的固定液，标记IgA、IgM、IgG等抗原效果良好。也有人认为它减弱细胞的抗原性，上皮细胞可产生非特异性荧光，故不宜用于免疫荧光标记。氯化汞是一种强蛋白凝固剂，但对组织穿透性弱，且使组织收缩，故与甲醛混合使用。 （6）醋酸-甲醛液（浓甲醛10ml，冰醋酸3ml，生理盐水加至100ml）。 Bullock等认为此液固定效果良好，组织可不经消化，胞浆IgA、IgG、IgM、IgD和K、λ、J链标记均呈阳性，且背景染色极淡。如标记IgG用PAP法第一抗体仅为甲醛升汞液的1/10。此液内醋酸既可防止组织收缩，又可暴露胞浆免疫球蛋白抗原决定簇。 （7）Bouin’s液。 该固定液为组织学、病理学常用固定剂之一，对组织穿透力较强而收缩性较小，比单独醛类固定更适合免疫组化染色。Kayhko认为用于标记B细胞的J链较好，但Bullock则认为它可导致Igg γ重链变性，故必需加大第一抗体的浓度。 （8）Zamboni’s液。 该固定液可用于电镜免疫细胞化学，对超微结构的保存优于纯甲醛，也适用于光镜免疫细胞化学研究。采用2.5%多聚甲醛和30%饱和苦味酸，更可增加对组织穿透力和固定效果，以保存更多的组织抗原。固定时间6-18h。 （9）PLP液（过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛固定液）。 该固定剂适用于富含糖类的组织，对超微结构及许多抗原的抗原性保存较好。其机制是过碘酸氧化组织中的糖类形成醛基，通过赖氨酸的双价氧基与醛基结合，从而与糖形成交联。组织抗原大多数是由蛋白质和糖两部分构成，抗原决定簇位于蛋白部分，故该固定液有选择性地使糖类固定，既稳定缺的，又不影响其在组织中的位置（固定剂7-9配制法见附录1）。 2．非醛类固定剂Pe等人比较几种非醛类双功能试剂指出，碳化二亚胺、二甲基乙酰胺、二甲基辛酰亚胺、和对苯醌等均适用于多肽类激素的组织固定，单独使用时，边缘固定效应重，但与戊二醛或多聚甲醛混合使用，效果明显改善。 （1）碳化二亚胺（1-ethyl-3(3-dimethyl-aminopropyl)cardodiimi-HCI）液：2g溶于100ml0.01mol/L,pH7.4PBS中。此液宜用于标记多肽类激素的组织，对标记IgA、IgG效果不佳。 （2）碳二亚胺-戊二醛液（ECD-G液）：配制法见附录一。 ECD-[1-ethyl-3(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimideHydrochloride],即乙基-二甲基氨基丙基碳亚胺盐酸盐，简称乙基-CDI。 该液常用于多肽类激素的固定，对酶等蛋白质固定效果良好，对细胞内抗原定位，超微结构保存好，是一种培养细胞电镜免疫细胞化学研究的良好固定剂。 （3）Zenker’s 液（重铬酸钾2.5g,氯化汞5g,硫酸钠1g,蒸馏水100ml,混合溶解后，临用时加水醋酸5ml）。 该固定液对免疫球蛋白染色最佳，固定时间约2-4h，染色前必须脱汞色素。 3．丙酮及醇类固定剂系最初免疫细胞化学染色的固定剂，其作用是沉淀蛋白质和糖，对组织穿透性很强，保存抗原的免疫活性较好。但醇类对低分子蛋白质、多肽及胞浆内蛋白质保存效果较差，解决的办法是和其它试剂混合使用，如加冰醋酸、乙醚、氯仿、甲醛等。 （1）Clarke氏改良剂（100%酒精95ml，冰醋酸5ml），用于冰冻切片的后固定。 （2）乙醚（或氯仿）与乙醇等量混合液。 Danos（1976）等认为其组织穿透性极强，即使涂片上富于过多的粘液，固定效果仍然良好，是理想的细胞固定液。 （3）AAF液：95%-100%酒精85ml，冰醋酸5ml，浓甲醛10ml。 （4）Carnoy氏液：100%酒精60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml，混合后4。C保存备用。 （5）Methacarn氏液：甲醇60ml，氯仿30ml，冰醋酸10ml，混合后4。C保存备用。 以上两种固定液适宜某些抗原，癌基因蛋白产物检测的 固定，P53抗癌基因蛋白产物，PC-NA等抗原的保存。 丙酮的组织穿透性和脱水性更强，常用于冰冻切片及细胞涂片的后固定，保存抗原性较好，平时4。C低温保存备用，临用时，只需将涂片或冰冻切片插入冷丙酮内5-10min，取出后自然干燥，贮存于低温冰箱备用。 以上介绍了免疫组织化学中常用的固定液，用于免疫组化的固定剂种类很多（见附录），不同的抗原和标本需经过反复试验，选用最佳固定液。不少学者认为，迄今尚无一种标准固定液可以用于各种不同的抗原固定。而且同一固定液固定的组织，免疫组化染色标记结果可截然不同，致使人们无所适从。选择最佳固定液标准是：①最好地保持细胞和组织的形态结构。②最大限度地保存抗原的免疫活性。一些含重金属的固定液在免疫组化技术中是禁用的。实际经验告诉我们，中性缓冲福尔马林（或多聚甲醛）是适应性较广泛的固定液，但固定时间不宜过长。必要时，可作多种固定液对比，从而选出理想的标准固定液。 固定组织时应注意：①应力求保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。②组织块不易过大过厚，必须小于2cm×1.5cm×0.3cm，尤其是组织块厚度必须控制在0.3cm以内。③固定液必须有足够的量，在体积上一般大于组织20倍以上，否则组织中心固定不良影响效果。④组织固定后应充分水洗，去除固定液造成的人为假象。 [b]（三）固定方法[/b] 1．浸入法（Immersionmethod）将组织浸泡在固定液内，必要时可在低温（4。C）环境下进行，固定时间可根据抗原的稳定性以及固定液性质而定，一般在2-12h之间。 2．灌注法（Irrigationmethod）此法适用于动物实验研究。自左心室插入主动脉，先以krebs或生理盐水冲冼血液后，以泵、吊筒或50-100ml注射器注入固定液。置灌注动物于4。C冰箱内，次日取出脑组织或其它组织。外周组织一般在灌注后30min内取材，取组织置同一固定剂中浸入1-3h，然后修整组织块。有主张用冷固定剂（4。C）进行灌注。我们的体会是一般光镜下观察的标本，室温固定即可获满意效果。应该强调，保持组织新鲜是很重要的，据报告，肽类抗原活性在断绝血液供应后24h几乎完全丧失。 灌注法固定可使固定液迅速达到全身各组织。达到充分固定之目的。灌注冲洗还能排除红细胞内假过氧化物酶的干扰。浸入法主要用于活检和手术标本，以及其它不能进行灌注的组织固定。