五、免疫细胞化学结果的判断

对免疫细胞化学结果的判断应持科学的慎重态度，要准确判断阳性和阴性，排除假阳性和假阴性结果，必须严格对照实验，对新发现的阳性结果，除有对照试验结果之外，应进行多次重复实验，要求用几种方法进行验证，如用PAP法阳性，可再用ABC法验证。必须学会判断特异性染色和非特异性染色，对初学者更为重要，否则会得出不科学的结论。特异性染色与非特异性染色的鉴别点主要在于特异性反应产物常分布于特定的部位，如胞浆内，也有分布在细胞核和细胞表面的，即具有结构性。特异性染色表现为在同一切片上呈现不同程度的阳性染色结果。非特异性染色表现为无一定的分布规律，常为某一部位成片的均匀着色，细胞和周围的结缔组织均无区别的着色，或结缔组织呈现很强的染色。非特异性染色常出现在干燥切片的边缘，有刀痕或组织折叠的部位。在过大的组织块，中心固定不良也会导致非特异性染色。有时可见非特异性染色和特异性染色同时存在，由于过强的非特异性染色背景不但影响对特异性染色结果的观察和记录，而且令人对其特异性结果产生怀疑。 [b]（一）阳性细胞的染色特征[/b] 免疫细胞化学的呈色深浅可反映抗原存在的数量，可作为定性、定位和定量的依据。 （1）阳性细胞染色分布有三种类型：①胞浆；②细胞核；③细胞膜表面。大部分抗原见于细胞浆，可见于整个胞浆或部分胞浆。 （2）阳性细胞分布可分为烟性和弥漫性。 （3）由于细胞内含抗原量的不同，所以染色强度不一。如果细胞之间染色强度相同，常提示其反应为非特异性。 （4）阳性细胞染色定位于细胞，且与阴性细胞相互交杂分布；而非特异性染色常不限于单个细胞，而是累及一片细胞。 （5）切片边缘、刀痕或皱折区域，坏死或挤压的细胞区，胶原结缔组织等，常表现为相同的阳性染色强度，不能用于判断阳性。 [b]（二）染色失败的几种原因[/b] （1）所染的全部切片均为阴性结果：包括阳性对照在内，全部呈阴性反应，原因可能是：①染色未严格按操作步骤进行；②漏加一种抗体，或抗体失效；③缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性；④底物中所加H2O2量少或失效；⑤复染或脱水剂使用不当。 （2）所有切片均呈弱阳性反应：①切片在染色过程中抗体过浓，或干燥了；②缓冲液配制中未加氯化钠和pH值不准确，洗涤不彻底；③使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反应时间过长；④抗体温育的时间过长；⑤H2O2浓度过高，呈色速度过快；⑥粘附剂太厚。 （3）所有切片背景过深；①未用酶消化处理切片；②切片或涂片过厚；③漂洗不够；④底物呈色反应过久；⑤蛋白质封闭不够或所用血清溶血；⑥使用全血清抗体稀释不够。 （4）阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应，固定和处理不当是最常见的原因。 对于阳性结果的定量判断常规方法是根据呈色深浅和阳性细胞数量分类计数，以（-）、+、++、+++等分级和计数统计。现在已采用图象分析计量，本书第九章　将详细叙述这种使免疫细胞化学的定量成为可能的先进的形态定量方法。另外，第十章　将详细途述另一种先进的免疫细胞化学计量分类术－流式细胞光度计技术。