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聚合酶链反应检测胃粘膜中的幽门螺杆菌

已经证实幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，Hp）是引起慢性B型胃炎的主要原因，在十二指肠溃疡病的发病机理中起重要作用，与胃癌的关系也越来越受到学者们的重视。诊断Hp感染的方法已有很多，其缺点是不够敏感，因此，需要一种快速、可靠，具有高度敏感性的检测方法。聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）用于检测Hp感染国外已有报道，国内也有人用此方法检测唾液中的Hp。本文报道了用PCR技术从胃粘膜活组织中检测Hp，并探讨该方法在Hp感染的诊断和在评价治疗后根除效果中的意义。 [b]1　材料和方法[/b] 1.1　PCR方法的建立 1.1.1　细菌菌株和培养 Hp标准菌株NCTC11637.NCTC11848及空肠弯曲杆菌NCTC11351来自伦敦国家标准培养物收藏中心（National Collectionof Type Culture），由本院传染科保存并提供。50株Hp临床菌株来自因胃肠症状在本院行胃镜检查的病人，取胃窦活组织标本一块，匀浆后接种于含万古毒素10μg/ml，两性毒素B2μg/ml甲氧苄淀（TMP）5μg/ml的7％羊血琼脂培养基，于37℃微需氧条件培养3d～7d。根据菌落形态、革兰染色，以及尿素酶、过氧化氢酶、氧化酶试验阳性进行细菌鉴定。金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、不动杆菌、克雷白肺炎杆菌、伤寒杆菌、阴沟杆菌、弗氏痢疾杆菌及胎儿弯曲杆菌由本院临床药理研究所提供。 1.1.2　细菌DNA的提取 Hp菌种转种于含7％羊血的琼脂培养基，37℃微氧条件培养3d，非Hp菌种按常规方法转种培养24～48h后收获。以氯化苄方法提取细菌DNA，所用试剂按文献相应减少。于分光光度计上测定HpNCTC 11637　DNA 的OD260及OD280，计算DNA浓度。 1.1.3　引物的选择 CP1/P2引物来自Hp16SrRNA基因，参考Hoshiua等提供的序列，由中国科学院遗传所合成并纯化。CP1：5'—GCGCAATCAGCGTCAGGTAATG—3'CP2：5'—GCTAAGAGATCAGCCTATGTCC—3'，扩增片段长度500bp。 1.1.4　PCR扩增Hp16SrRNA片段 采用50μl，扩增体系：10mmol/Ltris·HCI（Ph8.3）；50mmol/LKCL；1.5MMOL/LgCI2；0.01％明胶；各200umol/LdATP、dcTP、dTTp、dGTP（Boehringer公司产品）；各0.5μmcpl。CP2引物；1.25UTaqDNA聚合酶（中国科学院遗传所产品）；1μl模板DNA。拉增反应在Perkin－Elmer公司的DNa Thermal Cycler480上进行：96℃5min，1个循环；94℃1min变性，55℃1min退火，72℃1.5min延伸，35个循环；最后于72℃继续延伸10min。反应中以HpNCTC11637做阳性对照，以去离子水代替模板DNA做阴性对照。扩增产物以1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。 1.2　PCR检测胃粘膜活组织标本中的Hp 96名因上胃肠症状行胃镜检查的病人及25名因Hp感染经抗生素根除治疗后复查胃镜的病人，于胃窦部取粘膜活组织，分别做尿素酶试验（兰州军医学校生产试剂盒），细菌培养及Warthin－Starry银染检查（由本科专职病理医师完成）。另取胃窦粘膜活组织村本一块，置500μlTE（10mmol/LTris.HCI.1mmol/LEDTA）（pH8.0）缓冲液中研碎，加10％SD30μl蛋白酶K（20mg/ml）3ml，55℃消化1h，以等体积苯酚—氯仿提取模板DNA用于PCR检测，标本处理程中以缓冲液做阴性对照。 统计学处理采用配对四格表资料的X[SB]2[/SB]检验。 [b]2　结果[/b] 2.1　PCR方法的敏感性 采用10倍系列稀释的HpNCTC 11637DNA检测PCR反应的敏感性。1μg～0.1pg的DNA扩增后在1％琼脂糖凝胶上均产生可见的条带，检出的最低Hp DNA量为0.1pg，相当于100个细菌细胞。 2.2　PCR的特异性 引物CP1/CP2对Hp标准菌株NCTC 11637、NCTC11848及50株临床分离的Hp菌株扩增后均可产生500bp预期片段，而对13株非Hp菌株，包括金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、肺炎球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、变形杆菌、不动杆菌、克雷白肺炎杆菌、伤寒杆菌、阴沟杆菌、弗氏痢疾杆菌、胎儿变曲杆菌及空肠变曲杆菌NCTC11351均呈阴性反应；对无Hp感染的人胃粘膜也呈阴性反应。 2.3　PCR与常规检测方法的比较 ①PCR对初诊病人Hp感染的诊断：用PCR方示检测了96名因上胃肠症状前次行胃镜和胃粘膜活组织检查的病人，并与尿素酶试验、细菌培养和Warthin－Starry银染色等常规检测方法进行了比较（表1，2）。在四项检查方法中，PCR检出的阳性病人数最多，与尿素酶试验和细菌培养结果比较有显著性差异（P＜0.05）。PCR方法还检出2例上述三项常规检方法均为阴性的Hp感染者。所有细菌培养或银染色阳性的病人，用PCR检测均呈阳性。②PCR对药的物治疗后Hp是否根除的评价：用PCR方法检测了25名十二指肠溃疡病伴Hp感染经不同抗生素方案治疗的病人，并与尿素酶试验，细菌培养及银染色方法比较（表3）。发现其中20名病人常规三项检测方法均为阴性，认为Hp已被根除，然而用PCR方法检测却发现在这20名所谓Hp已被根除的病人中有4例Hp仍为阳性，从而表明药物治疗并未使这4名病人感染的Hp彻底根除。对这4名病人中的3名于停药后5月～6月复查，发现2名病人尿素酶试验、细菌培养及银染色均转为阳性。证明PCR能检出治疗后用常规方法治能检出、而实际上仍然存在的少量Hp。 表1　胃粘膜活组织4种方法检测Hp的结果
PCR尿素酶细菌培养银染色
阳性阴性阳性阴性阳性阴性
阳性587569632
阴性130031031
表2 PCR与常规方法阳性检出率的比较
检测方法n阳性数百分数（％）
PCR966567.7
尿素酶试验965961.5a
细菌培养965658.3a
银染色966365.6
[SB]a[/SB]P＜0.05，νsPCR 表3　十二指肠溃疡伴Hp感染治疗后检测结果
n尿素酶试验细菌培养银染色PCR
16－－－－
4＋＋＋＋
1－－＋＋
4－－－＋
[b]3　讨论[/b] 自从1983年Warren和Marshall报道从人胃粘膜中成功地分离出Hp以后，不少学者致力于Hp诊断的研究，旨在建立一种快速、简便，具有高度敏感性和特异性的诊断方法。当前，临床上应用最广泛的仍是通过胃镜取胃粘膜活组织做尿素酶试验、细菌培养及组织学染色（Warthin－Starry银染色）后做显微镜检查。尿素酶试验快速、简便，但常有假阳性和假阴性。细菌培养则要尽可能缩短接种前标本的转运时间，细菌生长缓慢且需要特殊的培养条件，球形Hp则不易培养成活。银染色后做显微镜检查虽然敏感性和特异性均高，但操作较烦琐，要求技术熟练程度高，且费时，价格较贵。非侵入性的方法如[SB]13[/SB]C或[SB]14[/SB]C呼气试验虽具有快速、可靠、无痛苦的优点，但费用较高，且接触同位素。血清抗体的检测则主要用于流行病学研究。作者的PCR方法与上述传统检测方法比较，不仅快速、简便，而且证实引物CP1/CP2对Hp的扩增是特异的，而对其它细菌和无Hp感染的人胃粘膜则无扩增产物出现。该方法只需从胃粘膜活检标本中粗提模板DNA，其检出的最小Hp DNA量为0.1pg，相当于100个细菌细胞，与文献报道结果相似。 本研究中将PCR技要用于Hp感染的诊断，并与传统的尿素酶试验、细菌培养及银染色方法进行了比较，9例细菌培养阴性及2例银染色阴性者，用PCR检测则全部为阳性。PCR与尿素酶试验及细菌培养的结果比较有显著性差异，而与银染色比较差异尚无显著性，可能由于受检样本数不够。以上结果表明，PCR技术确实较常规检测方法更为敏感，可以检出常规方法不能检出的Hp，是Hp感染的最敏感的方法。这与国外文献的结论一致。 本研究中将PCR技术用于抗生素治疗后检测Hp是否被根除，发现20例3项常规检测方法均为阴性认为Hp已被根除的患者，用PCR方法检测证实其中4例Hp仍为阳性。说明药物治疗并未使这4名病人感染的Hp彻底根除，只是细菌数量减少，用常规检查方法难以检出。对其中3名治疗后仅PCR呈阳性的病人的随访中证实，2名病人于停药后5个月和6个月时尿素酶试验、细菌培养及银染色均转为阳性，表明PCR用于评价药物治疗后Hp是否被根除，可以及早发现治疗不彻底，且在短期内感染可能复发的患者，从而指导继续药物治疗，防止同一株Hp感染的复发。