幽门螺杆菌的SDSP-AGE及免疫印渍分析

幽门螺杆菌（Helicobacterpylorida, Hp）现被公认为是慢性胃炎（CG）及消化性溃疡（PU）的致病因素之一。测定血清Hp抗体方法简便，敏感性高，特异性强，故日益受到关注。有关抗Hp-IgG检测的酶联免疫吸附试验（ELISA）已有报道，但Hp抗原中，哪一部分是免疫反应中抗原的决定簇，目前各家均在探讨。因此我们对Hp抗原作了十二烷基磺酸纳一聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和用人抗血清Hp和兔抗Hp血清作免疫印渍（Western blot），现报告如下。 [b]1 材料和方法[/b] 1.1 SDS-PAGE ①Hp抗原：为本室1989～1990年间分离培养的3株Hp抗原混合物。②CT抗原，由上海市卫生防疫站惠赠。③分子量标准蛋白。④电泳方法：分离胶和浓缩胶的聚丙烯酰胺浓度分别为10%和5%，分离胶的pH为8.8，浓缩胶的pH为6.8。 电泳前先将Hp、CJ全菌经超声粉碎，然后离心（2000r/min）15min，除去沉淀，经紫外线检测，上清液中蛋白含量为2mg/ml左右，加拌量为60μl，上样前加20μl的样品处理液，然后将标本煮沸5min。相对分子量标准蛋白分别为磷酸化酶94000，牛血清蛋白67000，卵蛋白43000，碳酸酐酶30000，大豆胰蛋白酶抑制剂20000，溶菌酶14000与样品作同步电泳。 1.2 免疫印渍分析 ①兔抗人Hp抗体：由本室免疫新西兰大白兔制成。②阳性血清：1989～1990年胃镜检查患者血清，1:100稀释后经ELISA后于波长490nm测定吸光度（A490）＞0.6者。同时，胃镜或胃粘膜病理证实有炎症或溃疡。尿素酶试验阳性。③阴性血清：选10岁以下正常儿童血清。1:100稀释后经ELISA测定后A490＜0.3者。④酶标羊抗人IgG的制备：按改良的过碘酸钠法，由本室制备。⑤酶标猪抗兔IgG：丹麦Daco公司产品，由上海市卫生防疫站生化免疫室惠赠。⑥硝酸纤维素（NC）纸：西德S&S公司产品，由上海市卫生防疫站生化免疫室惠赠。⑦免疫印渍：按Towbin等方法，由DY-Cl型电泳转移仪以2h400mA将SDS-PAGE胶上的抗原转移至NC纸上。将NC纸置Cohen封闭液中4°C过夜。次日，用含0.05%Tween-20的PBS洗涤3遍，再将NC分别浸于Hp阳性血清中（均为1:100稀释）。37°C振荡2h后，洗涤3遍，加酶标记的羊抗人IGG抗体和猪抗兔IGG抗体（1:400稀释）。37°C振荡2h后，洗涤3遍，再用酶底物显色液（pH7.2的Tris-HCl）缓冲液，0.05%DAB，0.03%的30%H2O[XB]2[/XB]）显色。 [b]2 结果[/b] 2.1SDS-PAGE 经超声粉碎后的Hp抗原被SDS-PAGE分离，胶块用考马斯亮蓝显色，可见14条左右的染色带。其主要染色带Mr分别为22000，32000，42000，59000，67000和75000。 经超声粉碎后的CJ抗原被SDS-PAGE分离后亦出现了10多条染色带。主要染色带Mr88000，75000，66000，45000和32000。 2.2Western blot 转移至NC上的Hp、CJ超声粉碎抗原用酶标羊抗人IGG抗体分析，发现在阳性血清的NC纸上，可出现三条抗原决定簇条带，其Mr分别为49000，59000和67000，与文献报道相似；加阴性血清的NC纸上，无任何条带出现。在国兔抗人Hp抗血清的NC纸上，用酶标猪抗兔IGG抗体分析，也出现了Mr67000的条带，49000和56000的条带较为模糊。在所有出现Hp抗原决定簇条带的NC纸上，CJ约在45000处与人抗Hp和兔抗Hp抗体均有一明显的交叉反应带。提示该条带并非是因人和兔都同时会有抗CJ抗体引起，而是Hp和CJ的表面蛋白抗原间有交叉反应。 [b]3 讨论[/b] 我们用SCS-PAGE加Westen blot将分离培养的3株Hp抗原经超声粉碎后，进行抗原成分的分析，在14条左右的候选抗原带中，发现其主要的抗原决定簇Mr为49000，59000和67000。由于处理抗原的方法不同（如用福尔马林固定的整菌抗原、超声粉碎抗原及酸处理抗原等），因此，SDS-PAGE的结果也就不很一致。但目前公认Mr60000～70000的条带是用IGG印渍的Hp主要免疫反应带，与本组结果相同。印渍带属Hp的鞭毛鞘膜蛋白。另外，Dunn等用二维电泳分离Hp蛋白时，在用125I标记的完整Hp菌表面发现两种主要蛋白。其中命名为蛋白Ⅱ的（pH5.6-5.8,Mr66000）既是尿素酶抗原的亚单位，也是部分纯化的鞭毛蛋白制备物的成分。他们还发现，蛋白Ⅱ不被完整的CJ、CF抗血清识别，因此，它是Hp的抗原决定簇。此点与本文也相符。我们没有发现110000的Hp特异性蛋白带，这可能与培养的Hp菌株的不同有关。当然也不能排除与处理抗原的方法不同有关。 抗原的特异性及标准化至关重要，它决定了该免疫学方法的敏感性和特异性。作者试图通过对Hp的抗原的SDS-PAGE加Westernblot检测，找出Hp的特异性抗原决定簇，并以此来取代全菌抗原，建立更为灵敏、特异的血清学方法，从而有助于由Hp引起感染的流行病学调查。由于本文所用的Hp株数量有限，因此它的抗原决定簇可能代表不了所有的Hp株，但它至少反应了1989～1990年间上海地区感染的Hp菌的抗原决定族。 Clayton等在用基因工程合成的Hp多肽作为抗原与Hp阳性血清作免疫印渍时亦发现66000的合成多肽是Hp的一个主要抗原决定簇。这就为今后简化Hp菌的培养以及Hp菌的标准化、商品化都提供了很好的前景。