第四节 寄生虫标本的保存
寄生虫标本的保存，除制成玻片标本永久保存外，还可用以下各种保存方法。
一、原虫包囊和虫卵的保存
汞碘醛液10ml与粪便1g混匀后密封在瓶内，可保存其中的原虫包囊及虫卵数月之久，也可在经浓集法处理的粪便沉渣中加等量或1倍量的10%甲醛液（加热至70℃），摇匀，用石蜡封固瓶口。
二、蠕虫成虫的保存
[b]1.线虫[/b] 生理盐水洗净后用加热至70～80℃的70%酒精或巴氏液（甲醛3份，生理盐水97份固定，冷却后移至新的70%酒精或巴氏液中保存。小型线虫（如旋毛虫、蛲虫、钩虫等）宜用甘油酒精（70%酒精95ml，甘油5ml）加热固定，保存于80%酒精中；也可用冰醋酸固定约半小时后移入70%酒精或甘油酒精中保存。
[b]2.吸虫[/b] 小型吸虫可置于小瓶中，加生理盐水，用力摇荡数分钟，倒去生理盐水，注入固定液。较大的吸虫应先放在薄荷脑酒精液（薄荷脑24g，95%酒精10ml）中，使虫体肌肉松弛，用载玻片压平后固定，或将洗净后的吸虫放在两片载玻片间用细线紧扎压平后固定。
固定一般用10%甲醛，24小时后移至5%甲醛中保存；或用70%酒精固定0.5～3小时，视虫体大小而定，再移至新的70%酒精中保存。
[b]3.绦虫[/b] 大型绦虫（如猪、牛带绦虫）经清水洗涤数次后，在生理盐水（4℃）中经过数小时或过夜，虫体可完全伸展，此时以3%福尔马林固定，24小时后移至5%福尔马林中保存，必要时也可先用大玻璃板压平后固定。小型绦虫洗涤后可在3%福尔马林中固定3～5小时，用载玻片轻压，沿盖玻片边缘加5%甲醛固定数小时，最后保存在5%福尔马林溶液中。
三、昆虫的保存
[b]1.干标本保存[/b]系保存有翅昆虫成虫。可用特制的昆虫针针插虫体。大型昆虫（蝇、虻等）用1～3号昆虫针，从虫体背面、中胸右侧直插（图21-9）。注意保持左侧完整，以便鉴定。小型昆虫（蚊、蛉、蚋、蠓等）可用00号短针自胸部腹面两中足基部之间插入，不可刺透胸背，再用另一长针从软木片另一端插下。最后各插一硬纸片，记录名称、采集地点与时间，并将之插于昆虫盒软木板上或玻璃管的软木塞上。昆虫盒内放入纸包的樟脑粉即可。如标本数量多（图21-9），可保存于塑料管（或玻璃管）中，管底放少量樟脑粉，再铺上棉花、滤纸各一层，昆虫标本放于滤纸上，用软棉纸包棉花，轻塞在昆虫标本上方，瓶口加软木塞，再以蜡封之。
[img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/rentijishengchongxue/rentijishengchongxue155.jpg[alt]有翅昆虫针插法[/alt][/img]
图21－9 有翅昆虫针插法
[b]2.湿标本保存[/b]用于保存有翅昆虫的卵和幼虫期及无翅昆虫和蜱螨类的发育各期。活标本先经加温的70%酒精（60～70℃）固定，一天后保存于5%甘油酒精（7%）中；也可用5%或10%福尔马林和Bless液固定保存。
所有保存标本须详细记录标本名称、宿主、采集地点、采集日期及采集者姓名。
樟脑混合剂配制：樟脑粉6份，氯仿1份，木馏油1份，石蜡油4份。先将樟脑粉1.5份与氯仿1份混合，随后加樟脑1.5份与木馏油1份，用玻璃棒混匀，最后加樟脑粉3份及石蜡油4份，再搅匀备用。此混合剂易燃，宜置于严密而不透气的瓶内储藏。
常用固定液配制：
⑴酒精：通常用70%或75%酒精为固定液。用商品供应95%酒精作稀释配制。取95%酒精加至需要稀释的浓度，再加蒸馏水到95ml即可；或者，可按下列稀释公式配制：
所需酒精浓度 ×配成酒精量=所需原酒精量（ml）原酒精浓度
配成酒精量-所需原酒精量=应加蒸馏水量（ml）
⑵福尔马林（37%～40%的甲醛水溶液）：常用固定液的浓度为5%～10%。如需保持中性，在配制过程中，可在500ml原液（37%～40%的甲醛水溶液）加入约2cm厚碳酸镁，或放几小块大理石（碳酸钙）中和之；也可采用下列配方配制（10%福尔马林）：福尔马林原液100ml，蒸馏水900ml，碳酸二氢钠（Na2H2PO4·H2O）4g，碳酸氢二钠（Na2H2PO4）0.5g混合配成。
⑶布氏（Bless）液：福尔马林原液7ml，酒精（70%）90ml，冰醋酸（临用前加入）3～5ml混合配成。
四、原虫低温保存
用液氮保存原虫，具有保持原虫生物学特性，且保存时间较长的优点。现仅介绍疟原虫、弓形虫、人毛滴虫及阴道毛滴虫的低温保存方法。
[b]1.冻存方法[/b]
恶性疟原虫：将从受染者采得的抗凝含虫血或体外培养的培养物，经1500rpm离心10分钟，加入与沉积细胞等量的24%二甲基亚砜（DMSO）生理盐水溶液（0.9%生理盐水或5%葡萄糖生理盐水76ml中加入DMSO24ml）保护剂，充分混匀后在室温中放置30分钟，按0.5～1.0ml分装入无菌安瓿（或塑料管）内，封口（或盖严）后将之放入标明批号的纱布袋中，装于液氮罐的提筒内，先置于液氮罐的颈部，该处约为-70℃，30分钟后，置液氮中（-196℃）冻存。
鼠疟原虫：从感染疟原虫第3～4天的小鼠心脏取血（或摘除眼球取血），注入试管，肝素抗凝，加入等量的10%或15%DMSO及15%或20%小牛血清为保护剂；或加入等体积的甘油、山梨醇保护液（4.2%山梨醇生理盐水180ml加纯甘油70ml），充分混匀。按照上法装管及冻存。也可以在1mm3阳性鼠血加0.1mm3的3.8%枸橼酸钠抗凝之后就装于液氮罐提筒中，立即直接置液氮中保存，2年内多数原虫仍有活力。
弓形虫：用无菌注射器吸取10%DMSO2ml，注入感染4天的小鼠腹腔，抽洗2次，抽出液混匀后即注入无菌塑料管内（0.5～1ml/管），冻存法同上。
阴道毛滴虫：用无菌拭子取阴道分泌物，放入培养基中培养48小时，转种于RPMI-1640培基中2天。取含虫培养液经1000rpm/min离心10分钟，在沉淀中加入10%DMSO2ml，同上法分装及冻存。
人毛滴虫：取腹泻患者的含虫粪便培养于洛氏培养基中48小时，转种于洛氏培养基或RPMI-1640培养基中培养2天后计算虫数（达7×105）。加等量10%DMSO并加Tween-20于DMSO中。装管同上法。但冻存过程应先将小管置于-10℃中15分钟，移到液氮罐颈2分钟，再置入液氮中冻存。
上述所用的保护剂（液）均应经高压灭菌，保存于4℃冰箱。RPMI-1640配制50%DMSO，用时再稀释所需浓度，加15%或20%小牛血清，调pH至7.2。
[b]2.复苏与观察[/b]在冻存1～2年，需要时从液氮罐中取出保种的小管，迅速投入37～40℃温水中，经4～5分钟即溶化。取冻存的鼠疟原虫和弓形虫分别经腹腔接种2只小鼠，每只0.2ml，观察致病情况；也可接种后4～5天分别取鼠血或腹腔液，作涂片，姬氏液染色，镜检原虫。两种毛滴虫可用同样方法复苏，但需经培养3～4天后，作涂片镜检活动滋养体，或染色观察。
