二、噬菌体载体

噬菌体（phage）是感染细菌的一类病毒，有的噬菌体基因组较大，加入λ噬菌和T噬菌体等；有的则较小，如M13、f1、fd噬菌体等。用感染大肠杆菌的λ噬菌体改造成的载体应用最为广泛。 λ噬菌体由头和尾构成，其基因组是长约49kb的线性双链DNA分子，组装在头部蛋白质外壳内部，其序列已被全部测出。λ噬菌体感染时，通过尾管将基因组DNA注入大肠杆菌，而将其蛋白质外壳留在菌外。DNA进入大肠杆菌后以其两端12bp的互补单链粘末端环化成环状双链，可以两种不同的方式繁殖（图20-3）：①溶菌性方式（lyticpathway）：在营养充足，条件适合细菌繁殖时，利用宿主菌中的酶类和原料，λDNA上基因可按调控的顺序表达合成构成噬菌体头、尾和尾丝所需的各种蛋白质，λDNA经多次复制合成许多子代λDNA，于是装配成许多子代的λ噬菌体，最后裂菌，释放出许多新的λ噬菌体。②溶原性方式（lysogenic pathway）：进入细菌的λDNA可整合(integrate）入细菌的染色质DNA中，随细菌染色体DNA复制，传给细菌后代，这个稳定潜伏在细菌染色质DNA中的λDNA称为原噬菌体(prophage)，含有原噬菌体的细菌称为溶源菌(lysogen)。λDNA的整合是可逆的，原噬菌体可从宿主DNA中切出，进入溶菌性方式的繁殖。 [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/shengwuhuaxueyufenzishengwuxue/shengwuhuaxueyufenzishengwuxue580.jpg[alt]λ噬菌体的溶菌和溶原繁殖方式[/alt][/img] 图20-3　λ噬菌体的溶菌和溶原繁殖方式 λ噬菌体整个基因组如图20-4所示，可分为三个部分，①左臂：从A到J长约20kb，其中的基因编码构成头部、尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的蛋白质。②中段：长约20kb，是λDNA整合和切出，溶原生长所需的序列。③右臂：长约10kb，是调控区，控制溶菌和溶原生长最重要的调控基因和序列、以及λDNA复制起始均在这区域内。左右臂包含λDNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生长所需全部序列；对溶菌生长来说，中段是非必需的。 利用λ噬菌体作载体，主要是将外来目的DNA替代或插入中段序列，使其随左右臂一起包装成噬菌体，去感染大肠杆菌，并随噬菌体的溶菌繁殖而繁殖。现在广泛使用的λ噬菌体载体也是已作过许多人工改造的，主要的改造是：①设计去除λDNA上的一些限制性酶切点。这是因为λDNA较大，序列中的限制性酶切点过多，妨碍其应用。②在中段非必需区，替换插入某些标志基因如上述的可供蓝白筛选lacI-lacZ’序列，和多克隆位点等。由此可构建出两类λ噬菌体作载体；一类是插入型载体，可将外来序列插中段，常用的λgt系列载体，一般容许插入5-7kb外来DNA；另一类是转换型载体，即可用外来DNA替代中段，如IMBL系列载体。 [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/shengwuhuaxueyufenzishengwuxue/shengwuhuaxueyufenzishengwuxue581.jpg[alt]野生型λ噬菌体DNA及相应的λ噬菌体DNA图谱[/alt][/img] 图20-4　野生型λ噬菌体DNA及相应的λ噬菌体DNA图谱 插入或置换中段外来的DNA长度是有一定限制的，当噬菌体DNA长度大于野生型λ噬菌体基因组105%或小于78%时，包装而成的噬菌体存活力显著下降。所以λ噬菌体载体可插入长5-20kb的外来DNA，这比质粒载体能插入的DNA长得多；而且包装的λ噬菌体感染大肠杆菌要比质粒转化细菌的效率高得多，所以λ噬菌体载体常用于构建cDNA文库或基因组文库。但λ噬菌体载体的克隆操作要比质粒载体复杂。 如果将左右臂和中段都去除，仅留下λDNA而端包装噬菌体所必需的cos序列，再加上质粒的复制序列、标志基因、多克隆位点等，就可构成cos质粒或称为粘粒的载体。粘粒可插入45kb长的外源DNA，然后用λ噬菌体外壳蛋白包装成噬菌体，感染大肠杆菌后，粘粒的DNA能以质粒的形式在细菌中繁殖而被克隆。所以粘粒主要用于DNA文库的构建。