三、限制性核酸内切酶的分类

按限制酶的组成、与修饰酶活性关系,切断核酸的情况不同,分为三类: Ⅰ类限制性核酸内切酶 由3种不同亚基构成,兼具有修饰酶活性和依赖于ATP的限制性内切酶活性,它能识别和结合于特定的DNA序列位点,去随机切断在识别位点以外的DNA序列,通常在识别位点周围400-700bp。这类酶的作用需要Mg2+,S腺苷甲硫氨酸及ATP。 Ⅱ类限制性核酸内切酶 与Ⅰ类酶相似,是多亚蛋白质,既有内切酶活性,又有修饰酶活性,切断位点在识别序列周围25-30bp范围内,酶促反应除Mg2+外,也需要ATP供给能量。 Ⅲ类限制性核酸内切酶 只由一条肽链构成,仅需Mg2+,切割DNA特异性最强,且就在识别位点范围内切断DNA。是分子生物学中应用最广的限制性内切酶。通常在重组DNA技术提到的限制性核酸内切酶主要指Ⅱ类酶而言。 表20-1 DNA重组技术中最常用的工具酶
主要用途
限制性核酸内切酶识别DNA特定序列,切断DNA链
DNA聚合酶Ⅰ或其大片段(Klenow)①缺口平移制作标记DNA探针
②合成cDNA的第二链
③填补双链DNA3’凹端
④DNA序列分析
耐热DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶等)聚合酶链反应(PCR)
DNA连接酶连接两个DNA分子或片段
多核苷酸激酶催化多核苷酸5’羟基末端磷酸化,制备末端标记探针
末端转移酶在3’末端加入同质多聚物尾
SI核酸酶,绿豆核酸酶降解单链DNA或RNA,使双链DNA突出端变为平端
DNA端酶Ⅰ降解DNA,在双链DNA上产生随机切口
RNA酶A降解除RNA
磷酸酶切除核酸末端磷酸基