二、限制性核酸内切酶

限制性核酸内切酶（restrictionendonuclease），又简称限制酶或内切酶。它们是基因工程和基因诊断重要的一类工具酶。它们的发现和应用为从基因组中分离目的基因提供了必要的手段.限制酶能特异地识别和切割特异的核苷酸序列，将双链DNA切成较小的片段。酶切后目的基因可能完整地或部分地保存于某一DNA片段上，并被分离出来。 限制酶主要来源于原核生物，是一组能水解DNA磷酸二酯键的酶。迄今已发现的限制酶多达数百种，分为三类。在基因工程中使用的主要是第二类。限制酶根据其来源命名。例如，限制酶EcoRⅠ来源于大杆菌E.coli的RY13菌株,Ⅰ指在该菌株中分离的第一个限制酶。 [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/yixueyichuanxuejichu/yixueyichuanxuejichu128.gif[alt][/alt][/img] 下面是一些最常用的限制酶的来源及其识别顺序(表13-1) 每种限制酶识别和切割的通常为4-6个核苷酸序列,称为限制性位点(restriction sites)或切点.限制酶切割双链DNA的方式有两种，产生的末端也有两种：第一种是交错切割，即两条链的切点不在同一水平而是相隔数个碱基，故断口产生两小段自身互补的单链，这种末端容易互补连接，称为粘性末端（cohesive terminus）；第二种为平整切割，即两　 表13-1 常用的限制酶的来源及其识别顺序列

名称	识别序列	来源
Ava	C↓( C )CG( A )G T G	Anabaena variabilis
Bam H	G↓GATCC	Bacillus amyloliquefaciens H
Bgl Ⅱ	A↓GATCT	Bacillus globigii
Eco RⅠ	G↓ * ATTC A	Escherichia coliRY13
Eco RⅡ	↓CC( A GG T	Escherichia coliR245
HaeⅢ	GG↓ * C C	Haemophilus aegyptius
HindⅢ	* ↓AGCTT A	Hemophilus influenzae Rd
HpaⅠ	GTT↓AAC	Haemophilus parainfluenzae
HpaⅡ	C↓ * GG C	同上
KpnⅠ	GGTAC↓C	Klebsiella pneumoniae
MboⅠ	↓GATC	Moraxella bovis
PstⅠ	CTGCA↓G	Providencia stuartii

*被甲基化 条链在同一水平切开，得到平齐末端（blunt terminus）(图13－2)。由于具有相同粘性 [img]https://baike.zhuayao.net/Uploads/zyzy/lilunshuji/yixueyichuanxuejichu/yixueyichuanxuejichu129.jpg[alt]限制酶的两类切割方式[/alt][/img] 图13－2 限制酶的两类切割方式 末端的DNA片段在DNA连接酶的作用下很容易共价连接，因此被广泛地应用于重组DNA操作中。具有相同平齐末端的DNA片段也可以连接，但连接效率只有粘性末端连接效率的1％。 限制酶的上述特性在基因工程和基因诊断中具有重要用途：①首先不论DNA的来源如何，用同一种内切酶切割后产生的粘性末端很容易重新连接，因此很容易将人和细菌或人和质粒任何两个DNA片段连接在一起，即重新组合，这是重组DNA技术的基础。②人类的基因组很大，不切割无法分析其中的基因。限制酶能把基因组在特异的部位切开，即切割不是随机的，因而从每个细胞的基因组得到的是相同的一组长度各异的片段。这些可能含有某一基因的片段可用电泳分离，并加以研究。③由于限制酶的特异性，如果识别位点的碱基发生了改变，限制酶将不再能切割；同样，碱基的改变也可能导致出现新的酸切位点。在人类基因组中，这两种情况是十分常见的，而切点的消失或出现将影响获得的DNA片段的长度，表现为限制性片段长度多态性（RFLP），这在基因的连锁诊断中具有极重要的意义。