四、无菌动物技术

无菌动物在自然界并不存,必须用人为的方法养育而成。一般将临产前的健康动物用麻醉药品或拉断颈椎处死后,立即浸泡在37℃灭菌液中,送进无菌室(或无菌隔离器),按无菌手术进行剖腹,切除带胎子宫(子宫内首先应无菌),将其浸入消毒液里并立即输送到另一只隔离器中,切开子宫取胎,经用灭菌纱布揩拭仔体并断脐(电刀切断)后,放入隔离器内人工喂乳或用其他品系的无菌雌鼠作保姆代养。象小鼠和大鼠等用人工喂乳非常麻烦,故采用保姆代养。而象豚鼠因在一定程度上能自力饮乳,故人工哺乳较容易。另外,象禽类、鱼类、昆虫类等,因是在卵中无菌的前提下作出的,故用药物将卵周围灭菌后移入灭菌隔离器内使其孵化即可,而且,这些动物,一般在出生后就能自力采食,故较易育成。 无菌动物的理论基础和实践依据在于胎盘屏障和屏障观念,根据这个基础开展了无菌动物工作。在无菌条件下取仔,一切操作在无菌隔离器内进行。 [b](一)哺乳类无菌动物技术[/b] 小动物作子宫切除术(Hysterectomy);大动物做子宫切开术(Hysterotomy)获得幼仔。子宫切开对兔子可用三次,但易污染,不如子宫切除术取仔安全。大动物主要从经济角度考虑,采用子宫切开取仔术。取仔程序如下: 1.腹部剃毛或用硫化钠脱毛剂脱毛。 脱毛剂配制: 硫化钡 50克 湿润剂 4克 甘油10克 水50毫升 作成类糊状用以脱毛。 2.处死妊娠雌鼠。一般不用化学药品处死,以兔影响胎鼠。如用化学药品时,应使剂量对胎体无影响时方可使用。一般对小鼠用断颈髓处死。较大的动物如豚鼠用氟烷(Halothane Oxygen)吸入麻醉,不用乙醚麻醉。 3.处死的雌鼠浸泡于37℃灭菌液中2分钟。灭菌液配制: 福尔马林20% 季铵5% 苄烷氨水75% 4.将妊娠鼠固定住,并于腹部粘上灭菌胶布。 5.剖腹。 6.取出子宫: ⑴将子宫放入灭菌液中,之后将盛子宫的小筐递到另一隔离器中取胎鼠。这样,在隔离器中有充分的时间检查其是否污染。 ⑵如将子宫直接在无特定病原体条件下取胎和饲养则有危险,可能受染而无机会观察。 7.用剪刀剪开子宫壁,取出胎鼠,轻按以帮助呼吸,不立即断脐,待呼吸正常时再用电刀切断脐带。 8.分开胎盘,将取出的幼仔放到代乳母鼠身边,把代乳母鼠的幼仔取出与剖腹产取出的幼鼠接触,使之有同样的气味,便于代养。 9.剖腹取胎的时限。 ⑴小鼠、大小:9-10分钟; ⑵豚鼠:5分钟,因豚鼠耐缺氧能力低弱。 乳汁制备:首先用挤奶机获得兔奶,冷冻干燥,经γ射线消毒,保存于塑料袋中,贮放在隔离器内。需用时将奶粉加水恢复干燥前的浓度,不加维生素和其他成份。须注意人工喂养经常出现因灌喂入肺而致死。家兔3次/日,后来发现1次/日即可。根据家兔年龄及体重考虑每两日加量1次。第1天喂5毫升,可维持1次/日;以后逐渐增加到4-5次/日;第3周时即可吃饲料。 自1958年以来,小鼠不用人工喂养。Sabourdy开始培育无菌小鼠时,每天喂5次,有时半夜去喂小鼠,实际上无此必要。自广泛使用隔离器后,都靠代乳鼠喂养。Sabourdy还认为中国如开始培育无菌动物工作,不必采用人工喂养,因现在各国有许多实验动物中心有无菌动物,运输也方便,可以从他的或别的实验室引进代乳鼠。 代乳鼠的最适期:在隔离器中交配,约于部腹服胎前1-2天产仔。C3H和C57BL品系为常用的代乳鼠。用作手术取胎的母鼠最好不是第一胎的。一般用做交配的雄鼠下午时放入,第二天上午8时将雄鼠取出。做剖腹产需了解雌鼠的妊娠期。特种鼠的妊娠期取足月的。小鼠性周期为4天多,如用100只雌鼠交配,应有25只雌鼠受孕,实际上若用10%已属不错。如果10只雌鼠受乳,用Whitten氏反应法,100只雌鼠可有30%受孕。 [b](二)鸟类无菌动物技术[/b] 常用鹌鹑,也用鸡。研究营养用无菌鸡,要选育无白血病的鸡群。饲养无菌鸡比较容易。雏鸡出壳即可啄食,不用人工喂饲。关键在于消毒卵壳,因卵壳不平,不易灭菌。首先选外壳干净的受精卵。按以下程序进行: 1.将受精卵放至湿润剂中。 2.再放入2%升汞中浸12分钟。 3.将浸泡过的受精卵放入隔离器中孵育。 建立无白血病鸡群无从母鸡选起,用这种鸡卵培育无菌鸡。否则仅外壳消毒是消灭不了鸡白血病病毒。